Uravnavanje izražanja genov preko interakcij DNA/proteini (Biomedicina)

Transcription

1 Uravnavanje izražanja genov preko interakcij DNA/proteini (Biomedicina) Uravnavanje izražanja genov molekularni mehanizmi in eksperimentalni pristopi (Genetika, Biotehnologija)

2 Uravnavanje izražanja genov RNA polimeraze, osnovni aparat in cikel transkripcije Mehanizmi prepisovanja in aktivacije Kontrola prepisovanja preko spremembe strukture kromatina Epigenetska kontrola Kombinirani dogodki pri prenosu signala Metode za študij interakcij DNA-proteini

3 2008

4 Razvijanje kromatina

5 Molekularni dogodki pri izražanju genov Prenos signala 30 nm vlakno razdružitev nukleosomov Premik nukleosomov s tkivno-specifičnimi faktorji 10 nm vlakno Prostorsko razporejanje DNA Aktivatorji prepisovanja polii Preiniciacijski kompleks

6 employees.csbsju.edu/.../ olbindtransciption.html

7 Tovarna RNA polimeraze II

8 Transkripcijski aparat Osnovni aparat RNA polimeraza Regulatorji (aktivatorji, represorji; trans-delujoči faktorji) Cis-elementi Cis-regulatorni moduli (CRM); vzpodbujevalci (enhacers), utiševalci (silencers)

9 Komunikacija med CRM in promotorjem

10 Struktura gena razreda pol II

11 Tipični pol II gen ima promotor, ki zavzema področje cca 200 bp navzgor od mesta pričetka prepisovanja. Lahko vsebuje tudi pospeševalec (enhancer), ki je oddaljen poljubno. GenesVII

12 Promotor (vzpodbujevalec) vsebuje razpršena DNA zaporedja za vezavo transkripcijskih faktorjev, je lokacijsko blizu vezavnega mesta RNA polimeraze. Osnovni (generični) promotor najkrajše DNA zaporedje, na katerem RNA polimeraza II še lahko prične transkripcijo; običajno vsebuje TATA zaporedje ali iniciator (Inr: Py2 C A Py5, položaj -3 do +5). Ni odvisen od tkivno specifičnih transkripcijskih faktorjev, prepisovanje pa je počasno. Enhancer (ojačevalec) vsebuje zvezna ali celo prekrivajoča-se DNA zaporedja za vezavo transkripcijskih faktorjev, je lahko zelo oddaljen od vezavnega mesta RNA polimeraze II. GenesVII

13 Core promoter-selective RNA polymerase II transcription Gross P, Oelgeschlager T., Transcription Laboratory, Marie Curie Research Institute, The Chart, Oxted, Surrey RH8 OTL, UK. The core promoter is defined as the minimal DNA region that is sufficient to direct low levels of activator-independent (basal) transcription by RNAP II in vitro. The core promoter typically extends approx. 40 bp up- and down-stream of the start site of transcription and can contain several distinct core promoter sequence elements. Core promoters in higher eukaryotes are highly diverse in structure, and each core promoter sequence element is only found in a subset of genes. So far, only TATA box and INR (initiator) element have been shown to be capable of directing accurate RNAP II transcription initiation independent of other core promoter elements. Computational analysis of metazoan genomes suggests that the prevalence of the TATA box has been overestimated in the past and that the majority of human genes are TATA-less. While TATA-mediated transcription initiation has been studied in great detail and is very well understood, very little is known about the factors and mechanisms involved in the function of the INR and other core promoter elements. Biochem Soc Symp. 2006;(73):

14 TATA-less promoters Molina and Grotewold BMC Genomics :25

15 Bakterije 1 RNA polimeraza Evkarionti RNA pol I (45s pre-rrna ) -RNA pol II (mrna kodirani geni, mirna) -RNA pol III (trna, 5S rrna)

16 Transkripcijski cikel

17 Transkripcijski cikel

18 Arhitektura RNA polimeraze II in razumevanje mehanizma prepisovanja Kristalna struktura (3A) 10 podenot RNA polimeraze II kvasovke S. cerevisiae. Velika homologija s človeškimi in bakterijskimi proteini 9/10 enot ohranjenih med evkariotskimi polimerazami I, II in III Cramer et al., Science 288, (2000)

19 Vezavno mesto za DNA-RNA hibrid Matrična veriga Kodirajoča veriga Cramer et al., Science 288, (2000)

20 Transkripcijski mehurček

21 RNA polimeraza se lahko premika v obe smeri

22

23 Osnovni aparat prepisovanja pri evkariontih Največ je poli genov

24 Začetek prepisovanja s pol II promotorjev potrebuje TFIID in TAFe

25 Splošni transkripcijski faktorji RNA polimeraze II TFIID: velik multiproteinski kompleks, ki prične sestavljanje transkripcijskega aparata. Vsebuje TBP in TAFe TFIIB: interagira z TBP in z DNA (analog bakterijskih σ faktorjev) TFIIF: udeležen pri iniciaciji kot pri podaljševanju verige. TFIIE: veže TFIIH TFIIH ima kinazno aktivnost, je helikaza, sodeluje tudi pri popravljanja DNA. Predstavlja povezavo med prepisovanjem in popravljanjem DNA in uravnavanjem celičnega cikla. TFIIA - po nekaterih izsledkih ne spada med splošne transkripcijske faktorje temveč med specializirane TFIID koaktivatorje. V pogojih in vitro veže TBP-DNA kompleks in povzroči širjenje DNA-protein kontaktov, obstajajo pa tudi dokazi, da ima pomen le pri kontaktiranju z gensko-specifičnimi transkripcijskimi faktorji.

26 Structural Basis of Transcription: An RNA Polymerase II-TFIIB Cocrystal at 4.5 Angstroms David A. Bushnell, Kenneth D. Westover, Ralph E. Davis, Roger D. Kornberg * The structure of the general transcription factor IIB (TFIIB) in a complex with RNA polymerase II reveals three features crucial for transcription initiation: an N-terminal zinc ribbon domain of TFIIB that contacts the "dock" domain of the polymerase, near the path of RNA exit from a transcribing enzyme; a "finger" domain of TFIIB that is inserted into the polymerase active center; and a C-terminal domain, whose interaction with both the polymerase and with a TATA box binding protein (TBP) promoter DNA complex orients the DNA for unwinding and transcription. TFIIB stabilizes an early initiation complex, containing an incomplete RNA-DNA hybrid region. It may interact with the template strand, which sets the location of the transcription start site, and may interfere with RNA exit, which leads to abortive initiation or promoter escape. The trajectory of promoter DNA determined by the C-terminal domain of TFIIB traverses sites of interaction with TFIIE, TFIIF, and TFIIH, serving to define their roles in the transcription initiation process. Bushnell et al., Science 303, (2004)

27 Model of the pol II transcription initiation complex with the addition of electron microscope structures of TFIIE, TFIIF, and TFIIH. Bushnell et al., Science 303, (2004)

28 TFIIB C in the pol II TFIIB complex and the inferred locations of TBP and promoter DNA in a transcription initiation complex. Bushnell et al., Science 303, (2004)

29 TBP TFIID spozna specifična nukleotidna zaporedja DNA. Sestavljen iz TBP in TAFov (s transkripcijo povezanih faktorjev). TBP prepozna TATA zaporedje DNA TBP Kristalna struktura TBP z DNA

30 TFIIB - sestavljen iz ene same polipeptidne verige. Interagira tako z DNA kot s TBP, ne prepozna specifičnega zaporedja DNA. TBP-DNA DNA verigi zelena in rumena TBP modra TFIIB rdeča in vijolična TFIIB-TBP-DNA

31 TAFi razreda II

32 S transkripcijo povezani faktorji (TAFi) so deli TFIID multiproteinskega kompleksa TAF II 40 in TAF II 60 vsebujeta domene, ki so homologne histonom H3 in H4. DNA ovijeta na podoben način, kot je ovita v nukleosomih. HFD histone folding domain domena, ki zvija histone

33 Bazična površina TAFII250 (TAF I) Povezani bromodomeni vežeta acetilirane histonske repke Jacobson, R.H. et al., Science 288, (2000)

34 Bromodomena in acetilacija histona H4

35 Model nastanka transkripcijskega kompleksa na kromatinski matrici Jacobson, R.H. et al., Science 288, (2000)

36 RNA polimeraze, osnovni aparat in cikel transkripcije povzetek Cikel transkripcije vsebuje začetek (iniciacijo), podaljševanje (elongacijo) in zaključek (terminacijo) Transkripcijo katalizirajo evolucijsko ohranjene RNA polimeraze. Evkarionti imajo RNA poi I, II in III. Potrebni pa so še drugi proteini (RNA polimeazni kompleks) Jedro RNA polimeraze vsebuje par klešč (clamp), ki tvorijo režo aktivnega centra encima za sintezo RNA. V stopnji podaljševanja DNA doseže aktivno mesto skozi kanal med kleščama, se denaturira (mehurček), rastoča RNA veriga pa tvori heterodupleks z matrično verigo DNA. NTP-ji dosežejo aktivno mesto skozi sekundarni kanal. Če polimeraza naleti na oviro, se lahko premakne nazaj (back-tracking). TBP je univerzalni transkripcijski faktot, ki prepozna TATA, potreben pa je tudi za prepisovanje s promotorjev brez TATA. TBP kompleks razreda II vsebuje TFIID, cca. 14 TAFov in TFIIB: TFIID prepozna promotor, TFIIB poveze TBP in RNA pol II. Bromodomena TAF I (TAF 250) acetilira hsitonske ostanke H4. helikazna podenota TFIIH izvaja hidrolizo ATP, ki jo Pol II sistem potrebuje za odprtje verige DNA, TFIIH sodeluje tudi pri popravljalnem mehanizmu in izvaja fosforilacijo C-terminala Pol II.

37