最終講義 化学本館 5 階講堂 見えないものを見えるようにする

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1 March 16, 2007 最終講義 化学本館 5 階講堂 見えないものを見えるようにする 梅澤喜夫 東京大学大学院理学系研究科化学専攻 umezawa@chem.s.u-tokyo.ac.jp : このマークが付してある著作物は 第三者が有する著作物ですので 同著作物の再使用 同著作物の二次的著作物の創作等については 著作権者より直接使用許諾を得る必要があります

2 序 Seeing what was unseen 生きた細胞内の分子過程を可視化する光プローブの研究 細胞内プロセスの直接解析を可能にする. STM 分子探針と分子間電子トンネル効果顕微鏡の開発

3 Imaging Molecular Events in Single Living Cells Fluorescence microscope Excitation Ion channel receptors Chemicals Kinase receptors Neurotransmitters Hormones Toxic substances Drugs Endocrine disrupters G Protein-coupled receptors Chemicals Cytosol G Object lens Second messengers Cell Ca 2+ camp cgmp DAG PIP 3 Protein phosphorylation Protein conformational change Protein protein interaction Protein localization

4 NO activates sgc that generates cgmp for the regulation of blood vessels QuickTimeý Dz TIFFÅiLZWÅj êlí ÉvÉçÉOÉâÉÄ Ç Ç±ÇÃÉsÉNÉ`ÉÉǾå ÇÈÇžÇ½Ç ÇÕïKóvÇ-ÇÅB

5 A fluorescent indicator for cgmp, CGY 440 nm CFP cgmp 480 nm PKG Iα + 2 cgmp - 2 cgmp 440 nm PKG Iα FRET YFP 535 nm 0 s 6 0 s s s s QuickTimeý Dz TIFF êlí ÉvÉçÉOÉâÉÄ Ç Ç±ÇÃÉs ÉNÉ`ÉÉǾ å ÇÈÇ ÇÕïKóvÇ- Ç QuickTimeý Dz TIFF êlí ÉvÉçÉOÉâÉÄ Ç Ç±ÇÃÉs ÉNÉ`ÉÉǾ å ÇÈÇ ÇÕïKóvÇ- Ç QuickTimeý Dz TIFF êlí ÉvÉçÉOÉâÉÄ Ç Ç±ÇÃÉs ÉNÉ`ÉÉǾ å ÇÈÇ ÇÕïKóvÇ- Ç QuickTimeý Dz TIFF êlí ÉvÉçÉOÉâÉÄ Ç Ç±ÇÃÉs ÉNÉ`ÉÉǾ å ÇÈÇ ÇÕïKóvÇ- Ç QuickTimeý Dz TIFF êlí ÉvÉçÉOÉâÉÄ Ç Ç±ÇÃÉs ÉNÉ`ÉÉǾ å ÇÈÇ ÇÕïKóvÇ- Ç 8 - B r - c G M P Emission ratio CFP / YFP 佐藤, 比田, 小澤, Anal. Chem. (2000)

6 Nitric Oxide (NO) N O 1. Cardiovascular system 2. Immune system 3. Nervous system

7 CGY CGY β sgcβ sgcα α Dimerization CGY CGY Amplification & detection α β NO α β CGY CGY NO An Amplifier-Coupled Fluorescent Indicator for NO (NOA-1) GTP cgmp Definitions NO : FRET CGY NO α β FRET CGY NO : CGY α β CGY CGY α β CGY : CGY α β CGY 佐藤, 比田, Proc. Natl. Acad. Sci., USA (2005)

8 ピコモル濃度領域の一酸化窒素 (NO) を検出するセンサー NO センサー細胞 Piccell 神経細胞 血管内皮細胞 細胞 CGY を導入 1 つ 1 つの細胞が NO のセンサー (Piccell) となる. NO センサー細胞 Piccell 可溶性グアニル酸シクラーゼ (sgc) は,NO と結合すると酵素活性が増大し, 細胞内に大量の cgmp を生成する. sgc を持つ細胞に,cGMP 蛍光プローブ分子 (CGY) を導入することで, NO を認識し,cGMP の増幅を介し,CGY により蛍光シグナルを発する NO センサーを構築した. 佐藤, 中嶋, 後藤, Anal. Chem. (2006) Piccell はピコモル濃度領域の NO を特異的に検出できる.

9 Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate; PI(3,4,5)P 3 Diacylglycerol; DAG OH

10 佐藤, 上田, 高木,Nature Cell Biol.(2003)

11 Subcellular dynamics of DAG in living cells 佐藤, 上田,Nature Methods (2006)

12 Protein Phosphorylation and Dephosphorylation OH Kinase O O P O O Phosphatase Protein CH 2 OH Serine (S) CH OH Threonine (T) CH 3 CH 2 OH Tyrosine (Y)

13 佐藤, 小澤,Nature Biotechnol.(2002)

14 キナーゼ Src の活性化の様子に男女差があることを発見 Before After 女性ホルモン (1μM Estrogen) Before After 男性ホルモン (1μM Androgen) 低 Src キナーゼ活性 高 一杉, 佐々木, 佐藤, 鈴木, J. Biol. Chem. (2007)

15

16 Protein A Principle of Detecting Protein-Protein Interactions Based on Protein Splicing N-DnaE N-luciferase Protein B Protein-Protein Interaction Protein Splicing C-DnaE C-luciferase 小澤, 貝原, 佐藤, 立原,Anal. Chem. (2001) luminescence Detection

17 生細胞内でのタンパク質間相互作用の高感度検出 従来法では見えない膜近傍での Ras Raf-1 間相互作用を高感度に検出できる. 菅野, 小澤, Anal. Chem. (2006)

18 An androgen promotes interaction between the androgen receptor ligand binding domain (AR LBD) and coactivator protein FRET 440 nm 480 nm 440 nm 535 nm CFP Androgen AR LBD Androgen High Linker Coactivator peptide YFP 0 min 10 min 20 min Emission ratio CFP/YFP Low アワイス, 佐藤,Angew. Chem. Int. Ed. (2006)

19 A Bioluminescent Probe for Imaging AR Translocation into the Nucleus Reconstitution of Renilla luciferase AR DnaE_C Rluc_C Probe-C Nuclear membrane +DHT nucleus cytosol Rluc_N DnaE_N Probe-N NLS DHT : dihydrotestosterone coelenterazine splicing Bioluminescence 金, 小澤,Proc. Natl. Acad. Sci., USA (2004)

20 Effects of inhibitors on AR translocation into the nucleus in the mouse brain Plasmid (A) Plasmid (B) FLAG rluc-n DnaEn NLS DnaEc rluc-c Androgen Receptor Experiments Time 0 hr 1 hr 3 hr (1) (2) (3) (1): COS-7 cells transiently co-transfected with pcrdn-nls and pcdrc-ar were implanted in the brain of mice. Soon after the implantation,. 100 μl of procymidone and PCB were injected intraperitoneally (i.p.). Photons/sec/cm 2 /sr (2): 100 μl of DHT was injected i.p. (3):coelenterazine was injected intracerebrally (i.c.) in the mice. DHT (-) DHT (+) DHT (+) + Procymidone DHT (+) + PCB PCB and procymidone have an ability to pass through the blood-brain barrier, to reach the brain and to inhibit the AR signal transduction in the organ. 金, 小澤,Proc. Natl. Acad. Sci., USA (2004)

21 A genetic approach to identifying mitochondrial proteins N-DnaE Mitochondria N-GFP Test proteins Interaction between DnaEs C-DnaE MTS Protein Splicing cytosol C-GFP GFP (Fluorescence) A method that allows rapid identification of novel proteins localized in mitochondria by screening large-scale cdna libraries Transmission Spliced GFP TMRE Merge 小澤, 佐古, 佐藤,Nature Biotechnol.(2003)

22 ミトコンドリア膜間腔局在化配列を同定した 膜間腔の ph を測定することを可能にした ミトコンドリア膜間腔局在化配列 RSVCSLFRYRQRFPVLANSKKRCFSELIKPWHKTVLTGFGMTLCAVPI ph センサータンパク質 YFP(H148G) ph 7.5 小澤, 名取,ACS Chem. Biol. (2007)

23 生細胞内におけるミトコンドリア RNA の検出 ミトコンドリア RNA Reconstituted Venus (Fluorescence) N-Venus C-Venus プローブが近接することで蛍光団が形成 プローブの蛍光団を破壊 プローブ ( 緑 ) ミトコンドリア DNA マーカー ( 赤 ) ミトコンドリア RNA はミトコンドリア DNA を離れ, 分散していく 小澤, 名取, 佐藤,Nature Methods (2007)

24 QuickTimeý Dz TIFFÅiàèkǻǵÅj êlí ÉvÉçÉOÉâÉÄ Ç Ç±ÇÃÉsÉNÉ`ÉÉǾå ÇÈÇžÇ½Ç ÇÕïKóvÇ-ÇÅB

25 Molecular Tips: Intermolecular Tunneling Microscopy molecular tip electronic interaction overlap of electronic wave functions facilitation of intermolecular electron tunneling molecular imaging

26 A fullerene molecular tip can detect localized and rectified electron tunneling within a single fullerene-porphyrin pair. Localized electron tunneling (ET) to spatially visualize the frontier orbital of the porphyrin involved in ET N Co C 18 H 37 O OC 18 H 37 N N N CoPor Fullerene Molecular Tip e Charge-Transfer Interaction facilitated electron tunneling 西野, 伊藤,Proc. Natl. Acad. Sci., USA (2005)

27 Electron tunneling within the single fullerene-porphyrin pair constitutes a molecular rectifier. sample positive gold tip C 60 e e sample negative 西野, 伊藤,Proc. Natl. Acad. Sci., USA (2005)

28 Electrically pinpointing complementary nucleobases 大城,Proc. Natl. Acad. Sci., USA (2006)

29 Pinpointing complementary nucleobases 大城,Proc. Natl. Acad. Sci., USA (2006)

30 結び 細胞内情報伝達において鍵となる生体情報分子を可視化 計測する技術の開発 STM 分子探針と分子間電子トンネル効果顕微鏡の開発 化学および生命科学の基盤技術として 化学と生物分野の発展に大きく寄与するものである.

31 教育の責任

32 博士課程修了者 ( 含む北大 ):34 名 < 進路先は例えば> Kansas State U., Assistant Professor U. Pittsburgh, Assistant Professor 東京大学助教授東北大学助教授和歌山大学助教授分子研助教授 ( 本年 10 月東京大学教授発令予定 ) 東京大学助手東北大学助手東京医科歯科大学助手静岡県立大学助手産総研主任研究員農業環境技術研究所主任研究員

33 QuickTimeý Dz TIFFÅiàèkǻǵÅj êlí ÉvÉçÉOÉâÉÄ Ç Ç±ÇÃÉsÉNÉ`ÉÉǾå ÇÈÇžÇ½Ç ÇÕïKóvÇ-ÇÅB

34 教官 ( 旧スタッフ, 含 : 北大 ) 菅原正雄 : 日本大学教授片岡正光 : 小樽商科大学教授小田嶋和徳 : 名古屋市立大学教授遠田浩司 : 富山大学教授 Philippe Bühlmann:U. Minnesota, Associate Professor 小澤岳昌 : 分子研助教授 ( 本年 10 月東京大学教授発令予定 ) 雨宮成 :U. Pittsburgh, Assistant Professor 佐藤守俊 : 東京大学助教授西野智昭 : 東京大学助手