学位論文の内容の要旨. SUPHANANTACHAT Supreda 論文提出者氏名 主査森田育男副査野田政樹 坂本啓 論文審査担当者

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1 学位論文の内容の要旨 論文提出者氏名 SUPHANANTACHAT Supreda 論文審査担当者 主査森田育男副査野田政樹 坂本啓 論文題目 A role for c-kit in the maintenance of undifferentiated human mesenchymal stromal cells ( 論文内容の要旨 ) Introduction The multipotency of human mesenchymal stromal cells (hmscs) and the feasibility of deriving these cells from the periodontal ligament hold promise for stem cell-based tissue engineering. However, the regulation of adult hmscs activity is not well understood. c-kit (CD117) is a type-iii receptor tyrosine kinase that transduces cell signaling events by binding its ligand, stem cell factor (SCF). Signaling events downstream of c-kit regulate cell proliferation, differentiation, chemotaxis, cell adhesion, and apoptosis. Only approximately 1% c-kit positive cells are found in hmscs derived from several kinds of tissue, including bone marrow, synovium, muscle, periosteum, lung parenchyma, and myocardium. Nevertheless, the role of c- Kit/SCF signaling in hmscs has not been well documented, most likely due to lower cell surface expression of the c-kit receptor in hmscs. To maintain stem cells properties and proper tissue function, the interaction between growth factors and stem cells is carefully controlled within the stem cell niche. Recently, recombinant growth factors have been introduced into periodontal regeneration. Periodontal ligament cells (PDLCs) stimulated with recombinant growth factors show increases in mitogenic activity and extracellular matrix deposition that further facilitate periodontal tissue regeneration. Despite the progressive development of clinically applicable growth factors, the mechanism by which growth factors manipulate or direct the behavior of human PDLCs remains unclear and should be elucidated to achieve the best outcome in regenerative therapy. This study investigated the presence and stem cell properties of c-kit positive (c-kit + ) hmscs derived from PDL tissue. The roles of c-kit and SCF in the regulation of MSC lineage-specific genes, including osteocalcin (OCN), runt-related transcription factor 2 (Runx2), osteopontin (OPN), peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ), and lipoprotein lipase (LPL), were evaluated. The effect of growth factors, including FGF-2, transforming growth factor- 1 (TGF- 1), and enamel matrix derivative (EMD), on c-kit gene expression were also examined. ( 2 )

2 Results Existence of c-kit + population in hmscs Flow cytometric analyses from seven study populations revealed that 0.65 ± 0.3% hmscs expressed c-kit. FACS showed three distinct expression patterns of c-kit surface receptor on hmscs; strongly positive cells (c-kit + cells), weakly positive cells or the main population of hmscs (> 95% of hmscs), and the c-kit-negative cells. An immunofluorescence study of the intensity of c-kit positive staining also confirmed the existence of 3 subpopulations of hmscs. The majority of hmscs stained weakly positive for c-kit, while smaller subsets were strongly positive or c-kit negative. Furthermore, a 3.6-fold increase in the expression of c-kit mrna was observed in c-kit + cells compared to the main population. Stem cell properties of c-kit + hmscs The c-kit + population of hmscs showed a significantly greater ability to form colonies than the main population, irrespective of the stimulation with recombinant human SCF (rhscf). After stimulation with 10 ng/ml rhscf, the number of colonies tended to increase in both populations but failed to show a statistical significance in comparison with the non-stimulating group. Both c-kit + cells and the main population showed a significant increase of alkaline phosphatase (ALP) activity after being induced by osteogenic inductive medium (OIM). Despite lower ALP activity in c-kit + cells upon induction with OIM, there was no significant difference when compared to the main population. In the absence of OIM, however, a significantly lower osteogenic potential was observed in c-kit + cells than in the main population. No difference in adipogenic potential was found between two populations. Effect of sirna-mediated knockdown of c-kit and/or SCF mrna on osteogenic and adipogenic differentiation potential The mrna expression of c-kit and/or SCF in hmscs was successfully inhibited by more than 80% after sirna transfection. The knockdown of c-kit and/or SCF genes enhanced ALP activity. The knockdown of c-kit and/or SCF genes resulted in the significant upregulation of Runx2, OCN, and OPN mrna expressions in hmscs after being cultured in OIM for 3 days. In the absence of OIM, the knockdown of c-kit or SCF alone significantly enhanced the mrna expression of OCN and OPN, while no change in Runx2 expression was observed. Knockdown of both c-kit and SCF genes resulted in the greatest increase of OCN and OPN mrna expression, by 22- and 17-fold, respectively. Adipogenesis-related gene expression was also affected by the suppression of c-kit/scf signaling at the mrna level. The mrna expression of PPARγ was significantly upregulated by 3-4-fold when both c-kit and SCF genes were knocked down with or without adipogenic induction, compared with each control group. In contrast, the mrna expression of LPL was undetectable in any of the groups in the absence of adipogenic induction. However, the 2.4-fold-upregulation of LPL gene ( 3 )

3 was observed in the dual knockdown group compared to the control group when cells were cultured in adipogenic inductive medium. Effect of exogenous growth factors on the mrna expression of c-kit The significant downregulation of c-kit mrna expression in hmscs was observed after a 24-h stimulation with ng/ml rhtgf-β1, ng/ml rhfgf-2, and μg/ml EMD. The efficacy of sirna-mediated knockdown of the receptors for TGF-β1, FGF-2, and EMD showed greater than an 80% reduction of mrna expression of each receptor. Transfection of sirna targeting receptors type 1 and/or 2 of TGF-β (TGFBR1/2) and FGF-2 (FGFR1/2) resulted in a significant upregulation of c-kit mrna in comparison to the control group. The dual knockdown of TGFBR1 and FGFR2 mrna resulted the highest level of c-kit mrna expression, with a 10- fold increase. Discussion In this study, approximately 1% of the c-kit + population was found in hmscs derived from PDL. These findings are comparable with previous reports in which FACS analysis was used to detect human lung stem cells, human cardiac stem cells, and hmscs derived from bone marrow, periosteum, synovium, adipose tissue, or skeletal muscle. In the present study, c-kit + cells showed a lower potential to differentiate into osteoblasts or adipocytes than that of the main population. In an attempt to clarify the role of c-kit and SCF in the maintenance of undifferentiated hmscs, sirna-mediated gene silencing was used to knock down endogenous c-kit and SCF genes, and the effects on osteoblastic and adipocyte lineage specific gene expression and functions were determined. The knockdown of c-kit/scf signaling significantly enhanced the expression of specific osteoblast markers, including ALP enzyme, Runx2, OCN, and OPN. Therefore, c-kit/scf signaling was surprisingly found to be indispensable for the control of bone-related gene expression in hmscs throughout a lineage transition from hmscs to mature functional osteoblasts. In terms of adipogenic differentiation, the results showed that the expression of PPARγ and LPL were significantly upregulated when both c-kit and SCF genes were concurrently knocked down. These findings suggested that c-kit/scf signaling suppressed the differentiation potential of hmscs. Interestingly, this study showed that external stimulation with TGF-β1 (1 ng/ml), FGF-2 (10 ng/ml), and EMD ( μg/ml), remarkably suppressed the gene expression of c-kit in hmscs. Knockdown of TGFBR1/2 and FGFR1/2, specific receptors for TGF-β1, FGF-2, and EMD, with sirna resulted in the significant upregulation of c-kit gene expression. The results of this study suggested that TGF-β1, FGF-2, and EMD enhanced the proliferative activity of hmscs by (1) suppressing the gene expression of c-kit and (2) subsequently releasing stem cells from an undifferentiated state to further proliferated and differentiated state. ( 4 )

4 Conclusions This study demonstrated an important role of c-kit in (1) maintaining the undifferentiated stage of hmscs by enhancing the colony-forming ability and (2) inhibiting the expression of lineagespecific genes. The gene expression of c-kit was specifically modulated by surrounding growth factors such as TGF-β1, FGF-2, or EMD. Collectively, the c-kit gene served as a control switch allowing stem cells to enter the cell cycle, leading to proliferation and subsequently differentiation into tissue-specific cell types. The modulation of the c-kit gene or c-kit/scf signaling might be considered as a future regenerative approach in directing the differentiation cues of hmscs. 和文による要約ヒト歯根膜由来間葉系幹細胞 (hmscs) は 優れた多能性と実用性を有し 幹細胞を用いた組織工学において確固たる地位を築いてきた しかしながら その活性調節に関しては不明な点が多い 一方で c-kit (CD117) 受容体は造血幹細胞において 増殖や分化に重要であることが知られており 心筋や肺組織における c-kit 陽性細胞の重要性が示されている そこで本研究ではまず歯根膜由来 hmscs における c-kit 受容体の発現をフローサイトメーターを用いて確認した 分画された c-kit 陽性細胞集団は 主集団と比較して コロニー形成能の有意な上昇を示したが 分化能に違いは認められなかった 一方で c Kit と c-kit 受容体のリガンドとして知られる幹細胞因子 (SCF) の遺伝子発現の抑制は アルカリフォスファターゼ (ALP) 活性の上昇と 骨芽細胞および脂肪細胞関連の遺伝子発現の上昇を示した またヒト歯根膜細胞において増殖や分化に影響することが知られているトランスフォーミング増殖因子 -β1(tgf-β1) 線維芽細胞増殖因子-2(FGF-2) やエナメルマトリックス抽出物 (EMD) は顕著に c-kit の mrna 発現を抑制した これらの結果より c Kit/SCF シグナルは hmscs の分化特異的な遺伝子発現を抑制することによって 未分化性維持に重要な役割を果たしていることが示唆された また 成長因子による hmscs の増殖や分化の制御にも関与しうると考えられた 以上のことから c-kit/scf シグナルによって hmscs の幹細胞性と分化能の両方をコントロールすることで hmscs を用いた再生医療の質的向上に寄与できるものと考えられる ( 5 )

5 論文審査の要旨および担当者 報告番号甲第 4757 号 SUPHANANTACHAT Supreda 論文審査担当者 主査森田育男副査野田政樹 坂本啓 ( 論文審査の要旨 ) c-kit (CD117) は幹細胞因子 (SCF) と結合する受容体であり c-kit/scf シグナルの活性化は様々な種類の細胞において多様な機能を制御する c-kit は造血幹細胞のマーカーとして知られているが 間葉系幹細胞 (MSC) の研究においては c-kit 陽性細胞が数パーセントしか存在しないため 長年注目されてこなかった しかしヒトの心臓幹細胞や肺幹細胞に見られる c-kit 陽性細胞が心筋や肺への分化能を持つことから 再生医療において注目されてきた 本研究ではヒト歯根膜由来間葉系幹細胞 (hmscs) を用いて c-kit 陽性 hmscs の存在と幹細胞能を明らかにすることを目的とした さらに hmsc の分化特異的遺伝子制御における c- Kit と SCF の役割にも着目した また線維芽細胞増殖因子 -2(FGF-2) トランスフォーミング増殖因子 -β1( TGF-β1) エナメルマトリックス抽出物(EMD) のような成長因子の hmsc の未分化性や c-kit の遺伝子発現への影響を調べた シグナル因子と幹細胞相互作用は幹細胞の運命決定に影響するため hmsc の活性を制御する c-kit の役割を明らかにすることは優れた研究目的であると評価できる 本研究ではヒト第三大臼歯より採取した歯根膜組織由来の hmsc を用いた hmsc における c-kit の発現はフローサイトメトリー解析 免疫化学染色 リアルタイム PCR により確認した c-kit 陽性分画と主集団の幹細胞活性の比較をコロニー形成能 アルカリフォスファターゼ (ALP) 活性 骨芽細胞 脂肪細胞分化試験により行った 次に ALP 活性と分化特異的遺伝子発現における c-kit と SCF への sirna の効果を調べた さらに hmscs の分化を制御すると考えられている成長因子 (rhtgf-1, rhfgf-2, EMD 等 ) を添加したときの c-kit 遺伝子発現の変化を調べた 主たる結果をまとめると以下である 1. フローサイトメトリー解析により hmsc において c-kit 陽性細胞が約 1% 示され c-kit 陰性 主集団 (c-kit 弱陽性 ) c-kit 陽性の 3 分画に分けられた また細胞免疫化学染色からも上記の 3 分画が観察された 各群に置ける c-kit の遺伝子発現を定量的 PCR で確認したところ c-kit 陽性細胞集団は主集団と比較して発現が高かった 2.c-Kit 陽性細胞集団は主集団と比べて有意にコロニー形成能が高かった 各群を石灰化誘導培地で誘導したところ 5 日後では c-kit 陽性細胞集団は主集団と比べて誘導時にアルカリフォスファターゼ活性は低かった 三週間骨芽細胞分化と脂肪細胞分化を両集団においてそれぞれ誘導したところ 違いは認められなかった ( 6 )

6 3.c-Kit 遺伝子を sirna を用いてノックダウンさせた状態で 石灰化誘導培地において培養したところ ALP 活性が上昇した さらには c-kit と SCF 遺伝子を sirna を用いてダブルノックダウンしたところ 骨芽細胞関連遺伝子の発現を有意に増強した よって c-kit シグナルは hmscs の骨芽細胞分化を負に制御していることが示唆された また hmscs を脂肪細胞分化条件で培養した際に c-kit と SCF 遺伝子を sirna を用いてダブルノックダウンさせたところ 脂肪細胞関連遺伝子の発現を増強した よって c-kit シグナルは細胞分化そのものを負に制御しており 幹細胞性の維持に関与していることが考えられた 4.hMSCs を分化誘導因子として既知である rhtgf-β1, rhfgf-2, EMD などで刺激すると c-kit の遺伝子発現を顕著に抑制した またそれらのレセプターである TGFBR1/2 and/or FGFR1/2 を sirna を用いてノックダウンしたところ c-kit の mrna 発現を顕著に増強した こられの結果から 以下のことが考察された c-kit 陽性集団は主集団と比べてコロニー形成能が高く分化能が低いことから c-kit/scf シグナルが未分化な hmscs の維持において重要な役割を担っている可能性が高い また hmscs における c-kit/scf の抑制は ALP 活性と骨芽細胞および脂肪細胞関連遺伝子発現を顕著に増強したことから c-kit/scf シグナルは hmscs の骨および脂肪分化経路の両方を制御すると考えられる また hmscs の骨芽細胞分化を誘導する成長因子として既知である TGFβ1, FGF-2, EMD は顕著に c-kit の遺伝子発現を抑制し さらにこれらの成長因子の受容体をノックダウンすると c-kit mrna 発現が顕著に上昇したことから c-kit/scf シグナル伝達と成長因子の間の特異的な相互作用が示唆された これらの考察が理論的に実施されており 論文中に明確に記載されている 本研究により c-kit/scf シグナル伝達の hmscs の未分化性における重要性が初めて明らかとなった また c-kit/scf シグナル伝達と成長因子の特異的な相関関係を明らかとした このことは hmsc の特性と制御における知識と理解を深める極めて重要な研究であるといえる さらに hmsc の幹細胞活性の調整に応用できる可能性もあり 細胞を用いた再生医療において hmsc の未分化な集団を選択して用いる新しい戦略を導く可能性がある 以上より本論文は 医歯学研究の発展に広く寄与すると考えられ 博士 ( 歯学 ) の学位申請を行うにあたって十分価値のあるものと認められた ( 7 )