UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA NINA BRUDAR. VPLIV KOBALT FERITNIH NANODELCEV NA RAST SONČNICE (Helianthus annuus L.

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA NINA BRUDAR VPLIV KOBALT FERITNIH NANODELCEV NA RAST SONČNICE (Helianthus annuus L.) DIPLOMSKO DELO LJUBLJANA, 2015

2 UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA DVOPREDMETNI UČITELJ NINA BRUDAR Mentorica: PROF. DR. KATARINA VOGEL MIKUŠ VPLIV KOBALT FERITNIH NANODELCEV NA RAST SONČNICE (Helianthus annuus L.) DIPLOMSKO DELO LJUBLJANA, 2015

3 KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dn DK UDK :546.73:620.3(043.2)=163.6 KG AV SA kobalt feritni nanodelci /kobaltov klorid /sončnica /Helianthus annuus L. /fotokemična učinkovitost fotosistema II (FS II) /fotosintezni pigmenti /masa BRUDAR, Nina VOGEL MIKUŠ, Katarina (mentorica) KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16 ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta LI 2015 IN TD OP IJ JI AI VPLIV KOBALT FERITNIH NANODELCEV NA RAST SONČNICE (Helianthus annuus L.) Diplomsko delo V, 30 str., 9 sl., 25 vir. sl sl/en Feritni nanodelci imajo magnetne lastnosti in jih zaradi tega uporabljajo v energetiki, medicini in elektroniki. Posledice uporabe se lahko kažejo v onesnaženosti prsti, industrijskih odpadnih vodah, in ne nazadnje ta negativni vpliv občutijo tudi organizmi. Sproščanje kobaltovih ionov iz feritnih nanodelcev ima negativen vpliv na rast in razvoj rastlin. Glavni cilj moje diplomske naloge je bil ugotoviti, kako različne koncentracije raztopin kobaltovega ferita in kobaltovega klorida vplivajo na rast in razvoj sončnice (Helianthus annuus L.). V predhodni raziskavi so bile rastline gojene dva tedna v hranilni raztopini z dodanimi različnimi koncentracijami (1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l) kobaltovega ferita (CoFe2O4) in koncentracijami (1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l) kobaltovih ionov v kobaltovem kloridu (CoCl2). Na rastlinah sem izmerila dejansko in potencialno fotokemično učinkovitost fotosistema II (FS II). Iz vsake skupine rastlin sem vzela korenine in poganjke ter jih pripravila za merjenje fotosinteznih pigmentov. Vsak vzorec sem stehtala in tako dobila svežo in suho maso. Pridobljene podatke smo analizirali s standardnimi statističnimi metodami. Z našo raziskavo smo ugotovili, da so bile tretirane rastline - v primerjavi s kontrolo - pod stresom, in sicer so imele nižjo fotokemično učinkovitost fotosistema II (FS II), manjšo suho maso in nižje koncentracije klorofila a in b. I

4 KEY WORDS DOCUMENTATION ŠD Dn DC UDK :546.73:620.3(043.2)=163.6 CX cobalt ferrite nanoparticles /cobalt chloride /sunflower /Helianthus annuus L. /photochemical efficiency of photosystem II (PSII) / photosynthetic pigments /mass AU AA BRUDAR, Nina VOGEL MIKUŠ, Katarina (supervizor) PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16 PB Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta PY 2015 TI DT NO LA AL AB EFFECT OF COBALT FERRITE NANOPARTICLES ON THE GROWTH OF SUNFLOWER (Helianthus annuus L.) Graduation Thesis V, 30 p., 9 fig., 25 ref. sl sl/en Ferrite nanoparticles possess magnetic properties and are therefore used in energy, medicine and electronics. The consequences of their use can be seen in soil pollution and industrial effluents and even organisms feel these negative effects. The generation of cobalt ions from ferrite nanoparticles has a negative impact on the growth and development of plants. The main objective of this dissertation was to determine how different concentrations of cobalt ferrite and cobalt chloride in solution affect the growth and development of a sunflower (Helianthus annuus L.). In a prior study, plants were grown in nutrient solution with different concentrations (1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l) of cobalt ferrite (CoFe2O4) and concentrations (1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l) of cobalt ions in cobalt chloride (CoCl2) for two weeks. We measured the actual and potential photochemical efficiency of photosystem II (PSII) in plants. We separated roots and shoots from every group of plants and prepared them to quantify measure photosynthetic pigments. Fresh and dry mass were determined by weighing each sample. We analysed the obtained data using standard statistical methods. In our research, we established that in comparison with the control group, the treated plants were stressed as they had a lower photochemical efficiency of photosystem II (PSII), a lower dry mass and lower concentrations of chlorophyll a and b. II

5 KAZALO VSEBINE KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA... I KEY WORDS DOCUMENTATION... II 1. UVOD HIPOTEZA PREGLED LITERATURE NANOTEHNOLOGIJA NANODELCI VIDEZ IN DELITEV NANODELCEV LASTNOSTI NANODELCEV ŠTUDIJE NA RASTLINAH VPLIV KOBALTA NA RASTLINE VPLIV KOBALT FERITNIH NANODELCEV (CoFe2O4) in KOBALTOVEGA KLORIDA (CoCl2) ŠTUDIJE NA ŽIVALIH NAVADNA SONČNICA (Helianthus annuus L.) MATERIAL IN METODE PRIPRAVA POSKUSA MERJENJE FOTOKEMIČNE UČINKOVITOSTI FOTOSISTEMA II (FS II) PRIPRAVA RASTLIN ZA MERITVE (sveža, suha masa) PRIPRAVA VZORCEV ZA MERJENJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV REZULTATI ANALIZA FOTOKEMIČNE UČINKOVITOSTI FOTOSISTEMA II (FS II) SUHA MASA RASTLIN KONCENTRACIJA FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV DISKUSIJA FOTOKEMIČNA UČINKOVITOST FOTOSISTEMA II (FS II) SVEŽA, SUHA MASA RASTLIN FOTOSINTEZNI PIGMENTI SKLEPI LITERATURA III

6 ZAHVALA IV

7 KAZALO SLIK Slika 1: navadna sončnica (Helianthus annuus L.)... 9 Slika 2: rastline, gojene v rastni komori Slika 3: merjenje fotokemične učinkovitosti fotosistema II (FS II) Slika 4: priprava vzorcev Slika 5: mešanje vzorcev na vorteksu Slika 6: Fotokemična učinkovitost fotosistema II (FS II) pri različnih tretmajih s kobaltovim feritom (povprečje ± standardna napaka, N = 6). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05) Slika 7: Fotokemična učinkovitost fotosistema II (FS II) pri različnih tretmajih s kobaltovim kloridom (povprečje ± standardna napaka, N = 6). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05) Slika 8: Suha masa poganjkov in korenin sončnic pri različnih tretmajih (povprečje ± standardna napaka, N = 6). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05) Slika 9: Fotosintezni pigmenti pri različnih tretmajih (povprečje ± standardna napaka, N = 6). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05) V

8 1. UVOD Nanotehnologija je znanost, ki proizvaja in uporablja nanostrukturne delce, ki merijo v eni dimenziji<100 nm (Rana in Kalaichelvan, 2013). Feritne nanodelce (NPs), ki imajo magnetne lastnosti, se uporablja na različnih področjih, kot so medicina, elektronika ter energetika. Zaradi tega lahko pride do povišanih koncentracij kobaltovega ferita v industrijskih odpadnih vodah, okoliški zemlji in tako do negativnih vplivov na organizme. Eno od pomembnih vprašanj, ki jih je potrebno razrešiti, preden se te nanodelce lahko širše uporablja in varno nadzoruje, se nanaša na proces odtapljanja kobalta od kobaltovega ferita. Kobaltovi ioni lahko povzročijo nastanek kisikovih reaktivnih spojin (KRS), oksidirajo proteine in povzročijo oksidativne poškodbe DNA. Ugotovljeno je bilo, da na stopnjo odtapljanja vplivata predvsem ph ter specifična površina nanodelcev. Organske spojine v celičnih medijih lahko povečajo ali pa zmanjšajo sproščanje ionov iz nanodelcev. To je odvisno od njihove kemijske sestave ter koncentracije (Novak idr., 2013). Rastline imajo različne fiziološke in morfološke prilagoditve, ki določajo uspešnost neke vrste na določenem rastišču. Z mehanizmi izločanja organskih kislin iz korenin lahko vplivajo na biokemično sestavo rizosfere in posledično stopnjo odtapljanja kobalta s feritnih nanodelcev. Kobaltovi ioni, ki se sproščajo, so za rastlino strupeni in lahko posledično negativno vplivajo na rast in razvoj rastlin. Rastline, ki so pod stresom zaradi Co ionov, imajo nižjo fotokemično učinkovitost fotosistema II (FS II) in posledično slabše rastejo in se razvijajo (Novak idr., 2013). Cilj diplomske naloge je bil ugotoviti, kako različne koncentracije raztopin kobaltovega ferita in kobaltovega klorida vplivajo na rast in razvoj sončnice (Helianthus annuus L.). Vpliv različnih koncentracij kobaltovega ferita in kobaltovega klorida smo preverjali z merjenjem rastnih parametrov (sveža, suha masa), merjenjem potencialne in dejanske fotokemične učinkovitosti fotosistema II (FS II) ter z analizo vsebnosti fotosinteznih pigmentov. Sončnico smo izbrali zato, ker je pomembna industrijska rastlina, ki hitro raste in jo je enostavno gojiti na hidroponskem sistemu. Poleg tega pa proizvede veliko biomase. Sončnice smo tako gojili dva tedna v hranilni raztopini z dodanimi različnimi koncentracijami (1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l) kobaltovega ferita (CoFe2O4) in koncentracijami (1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l) kobaltovih ionov v kobaltovem kloridu (CoCl2). Dobljene vrednosti merjenih parametrov na teh rastlinah pa smo primerjali z vrednostmi merjenih parametrov na kontrolnih rastlinah. 1

9 2. HIPOTEZA Naši hipotezi sta: Naraščajoče koncentracije kobaltovih ionov in kobaltovega ferita bodo imele negativen učinek na rast in razvoj rastline. Pri mladih rastlinah sončnic, ki bodo rasle v hidroponski raztopini/suspenziji z različnimi koncentracijami kobaltovih ionov in nanodelcev kobaltovega ferita, se bodo pojavile spremembe v koncentraciji fotosinteznih pigmentov, suhi masi ter fotokemični učinkovitosti fotosistema II (FS II). 3. PREGLED LITERATURE 3.1 NANOTEHNOLOGIJA Predpona»nano«izhaja iz grške besede»nannos«, kar pomeni škrat oz. pritlikav. Vendar pa se nano že dolgo uporablja kot predpona v znanstvenih krogih za pomen ene milijardinke (Whatmore, 2006). Nanotehnologija je veda, ki se ukvarja s specifičnimi lastnostmi nanomaterialov. Nanodelci pa so skupki materiala, ki ne presegajo velikosti 100 nanometrov (Remškar, 2009). Nanoznanost je študija pojavov in manipulacija snovi na atomski, molekularni in makromolekularni ravni, kjer se lastnosti znatno razlikujejo od tistih v večjem obsegu. Domnevno je prisotna že od začetka 20. stoletja, vendar je ideja, da obstajajo nekatere tehnološke prednosti, ki bi jih pridobili z delom v zelo majhnem obsegu, prišla veliko pozneje. Prvi jo je leta 1959 predlagal fizik Richard Feynman (Whatmore, 2006). Nanotehnologija se neprestano hitro razvija in ima danes in prav tako v prihodnosti zelo velik vpliv na vsa področja znanosti in tehnologije. Veliko znanstvenikov meni, da bo to povzročilo novo industrijsko revolucijo (Remškar, 2009). Torej ni nobenega dvoma, da ima tehnologija, povezana z našo sposobnostjo manipulacije snovi v zelo majhnem obsegu, zelo velike vplive na naša življenja in ta vpliv se bo samo še povečeval (Whatmore, 2006). 2

10 Prehrambna industrija se vedno bolj poslužuje nanotehnologije zaradi lažje pridelave bolj kakovostne hrane in zagotovljene varne uporabe nanomaterialov v prehrambni verigi. Pridelan proizvod je nanohrana, v katero so primešani nanomateriali (Remškar, 2009). 3.2 NANODELCI VIDEZ IN DELITEV NANODELCEV Znanstveniki so raziskali, da oblika nanodelca definira njegovo površino in prav tako odloča o prostih vezeh in električnem naboju na tej površini, ki posledično vpliva tako na kemijske kot tudi fizikalne lastnosti posameznega delca. Prav tako ima oblika delca velik vpliv na aerodinamični premer, ki pa je ključen za razumevanje uhajanja teh delcev v ozračje ter premikanja po telesnih tekočinah (Remškar, 2009). Manjši nanodelci so lahko iglice okrogle oblike, medtem ko imajo večji nanodelci obliko oktaedra (Novak idr., 2013). Glede na njihov izvor oziroma namensko proizvodnjo jih delimo v tri velike skupine, in sicer na inženirske, naravne ter nenamensko proizvedene. Med inženirske, ki so namensko narejeni zaradi njihove velikosti, sodijo: kovine, kovinski oksidi, ogljikovi in polimerni delci ter hibridni nanodelci (organsko-anorganski, anorgansko-anorganski) (Remškar, 2009). Med naravne vire kobaltovih nanodelcev štejemo te, ki v naravi nastajajo zaradi vulkanskih izbruhov in gozdnih požarov (Ursache-Oprisan, Focanici, Creanga in Caltun, 2011). Nenamensko proizvedeni pa nastajajo pri gorenju, v motorjih z notranjim izgorevanjem, v gradbeništvu, razpršilnih tehnologijah (Remškar, 2009) LASTNOSTI NANODELCEV Industrijsko jih je možno proizvajati skoraj iz vsake kemikalije. Pomembno je to, da se ti nanodelci v plinu ali tekočini združijo v večje skupke, ki jih imenujemo aglomerate. Tvorba aglomeratov pa je odvisna tako od koncentracije kot tudi od kemijskih značilnosti medija (Drobne, 2007). Raztopljeni nanodelci CoFe2O4 kažejo močno aglomeracijo v destilirani vodi (Novak idr., 2013). 3

11 Imajo določene lastnosti, v katerih se razlikujejo v toksičnem potencialu v primerjavi z materiali (iz enake kemijske sestave), iz katerih izvirajo (Borras, 2011). Naj omenim tudi pomembnost njihove kemijske strukture, ker je pomembna z vidika topnosti v polarni vodi in drugih bioloških tekočinah. Kovinski nanodelci so običajno dobro topni in se postopoma raztapljajo v ione. Ioni pa lahko sprožijo za organizme nezaželene kemijske reakcije. V primeru povečane kemijske aktivnosti se nanodelci ob srečanju med seboj združujejo v gruče. Zaradi termične energije so v tekočinah in plinih podvrženi Brownovemu gibanju. Hitrost gibanja delca je odvisna od temperature zraka ter mase delca (Remškar, 2009). Znano je, da nanodelci delujejo na organizem prek oksidativnega stresa (Drobne, 2007). Raziskave kažejo, da v primeru vstopa prevelikega števila vseh zelo majhnih delcev, ti niso za človeka smrtno nevarni. Razlog je v tem, da je človeški organizem razvil obrambne mehanizme (Remškar, 2009). Nanodelci ne razpršijo vidne svetlobe. Dobro absorbirajo ultravijolično (UV) svetlobo, kot primer naj navedem titanov dioksid, ki se dandanes pojavlja v obliki nanodelcev za zaščito pred soncem. Dejstvo, da so delci tako majhni, pomeni, da so nevidni na koži, pri čemer pa so še vedno močno učinkoviti kot UV blokatorji. Zelo majhni delci imajo veliko površino na enoto mase. Torej manjša kot bo velikost delca, večja bo njegova površina glede na volumen (Whatmore, 2006). Poleg drugih lastnosti imajo ti majhni delci povečano absorpcijo (še posebej na nenavadne načine, kot npr. z inhalacijo ali s kožo) in so zmožni prečkanja meja, ki so v drugih razmerah neprehodne (npr. krvno-možganska pregrada ali očesna mrežnica), prodirajo v organe ali tkiva, ki so težko dostopna drugim spojinam, ali pa medsebojno vplivajo na celične organe le v posebnih in atipičnih pogojih (Borras, 2011). Papis idr. (2009) so pokazali, da se sprostitev Co 2+ iz nanodelcev zgodi v vsakem testiranem mediju, toda ostaja pod 1 % celotnega kobalta v mediju. Horev-Azaria idr. (2011) so določili odstotek izluževanja/uhajanja/izpiranja kobaltovih ionov iz kobaltovih nanodelcev v Dulbeccovem modificiranem mediju Eagle (DMEM), hkrati pa ugotovili, da je 72-urna inkubacija kobaltovih nanodelcev imela za posledico razgradnjo 44 ± 10 % kobaltovih nanodelcev. 4

12 CoFe2O4 nanodelci so zelo uporabni za tehnološke (magnetne tekočine, magnetno hranjenje informacij) in biomedicinske namene. Pridobivajo jih z različnimi sinteznimi metodami, kot so sol-gel, hidrotermalna sinteza, termični razpadi organskih kompleksov (npr. oleatov) (Gyergyek, Makovec in Drofenik, 2008). 3.3 ŠTUDIJE NA RASTLINAH Nekaj študij se je osredotočilo na učinke mehanizmov nanodelcev na rastline. Rezultati so pokazali številne povezave med rastlinami in nanomateriali. Kar zadeva izmenjavo snovi, so višje rastline v močni interakciji z atmosfero in kopenskim okoljem, kar kaže na to, da bodo ti organizmi občutili vse vplive okolja in atmosfere. Torej nanodelci močno vplivajo na njihovo biodiverziteto. Občutljivejše rastline bodo namreč začele propadati, ker nanodelci zavirajo njihovo rast, cvetenje ter tvorbo plodov. Preživele bodo le bolj prilagojene rastline. Nanodelci imajo tako pozitiven kot tudi velik negativen učinek na rast in razvoj rastlin (Monica in Cremonini, 2009). Fitoremediacija je tehnologija čiščenja, ki uporablja ustrezne rastlinske vrste za čiščenje onesnažil, kot so kovine, organske ali radioaktivne snovi v zemlji, podtalnici in industrijskih odpadkih. Vključuje splošne biološke, kemijske in fizikalne procese, ki omogočajo vnos, skladiščenje, degradacijo in metabolizacijo onesnažil, ki se nahajajo v rastlinski rizosferi. Na podlagi študije fitoremediacije se uporablja hiperakumulatorske rastline, ki lahko akumulirajo nenavadno visoke količine kovin v tkivih (Jaleel in Jayakumar, 2009) VPLIV KOBALTA NA RASTLINE Kobalt je prehodni element in je glavna sestavina številnih encimov in koencimov nekaterih organizmov, kot so npr. alge, glive in mahovi. Učinkovito sodeluje z drugimi elementi, ki tvorijo komplekse. Privzem je pod nadzorom različnih mehanizmov pri različnih vrstah. Fizikalni pogoji, kot so slanost, temperatura, ph medija in prisotnosti drugih kovin, vplivajo na proces sprejemanja in akumulacije v algah, glivah ter mahovih (Palit, Sharma in Talukder, 1994). 5

13 Za večino rastlin ni obravnavan kot esencialen element. Rastline ga lahko privzemajo nenačrtno (Plant & soil Sciences elibrary, 2015). Relativno nizke koncentracije Co 2+ v mediju stimulirajo rast tako pri preprostih algah kot tudi pri kompleksnih višjih rastlinah. Njihov ugodni učinek se kaže v zaostajanju staranja v listih, povečanju odpornosti na sušo v semenih, urejenem kopičenju alkaloidov v zdravilnih rastlinah in ne nazadnje v inhibiciji etilen biosinteze. Co 2+ pomaga pri fiksaciji molekularnega dušika v koreninskih gomoljih stročnic (Palit idr., 1994). Relativno višje koncentracije Co 2+ so za rastline strupene, saj poškodujejo celične membrane, spremenijo lahko encimsko aktivnost, motijo celične funkcije ter poškodujejo zgradbo DNK (Jaleel in Jayakumar, 2009). Prav tako imajo negativen vpliv na morfološke lastnosti, ki vključujejo zmanjšanje velikosti listov, zaviranje ozelenitve, brezbarvne žile in zmanjšanje mase (Palit idr., 1994). Pri višjih rastlinah poteka absorpcija Co 2+ prek koreninskega sistema, in sicer z masnim tokom. Po ksilemu se Co 2+ transportira v obliki hidriranih ionov, v glavnem s transpiracijskim tokom. Kobaltovi ioni zavirajo aktivnost fotosistema II in posledično tudi Hillovo reakcijo. Prav tako Co 2+ zmanjšuje izvoz fotosimilatov in fiksacijo CO2. Visoke koncentracije kobalta ovirajo sintezo RNA. Hkrati pa se spremeni delovanje endo in eksonukleaz (Palit idr., 1994). Ugotovili so tudi, da je topnost ključni dejavnik, ki vpliva na njegovo toksičnost za rastline (Li, Gray, Mico, Zhao in McGrath, 2009) VPLIV KOBALT FERITNIH NANODELCEV (CoFe2O4) in KOBALTOVEGA KLORIDA (CoCl2) Do sedaj je bilo narejenih zelo malo študij na rastlinah. Rezultati izpostavitve navadne soje (Glycine max) s Co 2+ pri stopnji 50 mg na 1kg zemlje (globina do 20 cm) so pokazali, da je ta izpostavitev ugodna za splošno rast te rastline. Torej se je v majhnih koncentracijah izboljšal koreninski sistem ter povečal absorpcijo vode in v njej raztopljenih hranilnih snovi. Razlog je v tem, da je soja metuljnica, ki tvori simbiozo z bakterijami, ki fiksirajo dušik. Za te rastline je Co esencialen element (Jaleel in Jayakumar, 2009). 6

14 Drugi avtorji poročajo, da so tako kobaltovi nanodelci kot kobaltovi ioni odgovorni za učinke na celice, in hkrati pojasnjujejo, da je narava učinkov odvisna od vrste celične linije, trajanja izpostavljenosti in nanesene koncentracije nanodelcev (Novak idr., 2013). Ponti idr. (2009) so poročali, da je bila toksičnost višja za kobaltove nanodelce kot za kobaltove ione po dveh urah in po 24 urah izpostavljenosti, medtem ko so Papis idr. (2009) dokazali, da ima Co 2+ hujši citotoksični učinek na človeške celične linije v primerjavi z nanodelci Co3O ŠTUDIJE NA ŽIVALIH Novak idr. (2013) so v času 14 dni trajajočega eksperimenta ugotovili, da izpostavljenost kopenskih enakonožcev nanodelcem (CoFe2O4) ni imela večjega vpliva na stopnjo hranjenja in destabilizacijo membran prebavnih celic. V vseh živalih, izpostavljenih odmerkom hrane z nanodelci CoFe2O4, so bile sicer koncentracije Co statistično bistveno višje kot pri tistih, ki so jih izmerili v kontroli, kjer je bil Co v večini primerov pod mejo detekcije. Pričakovali pa so izredno visoke koncentracije Co, izmerjene pri živalih, hranjenih z odmerki hrane Co 2+. Toksični učinki so bili pripisani kobaltovim ionom, in ne samim nanodelcem CoFe2O4. Citotoksičnost in fitotoksičnost kobalta in njegovih spojin je odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti teh kompleksov, vključno z njihovo elektronsko strukturo, ionskimi parametri (velikost naboja) in koordinacijo (Palit idr., 1994). Z in vivo študijo so to dokazali, in sicer je bila opazovana toksičnost kobalta in njegovih spojin vidna, v zmanjšani stopnji prehranjevanja živali. Citotoksičnost pa je bila razvidna iz spremenjene stabilnosti celične membrane. Na podlagi tega lahko zaključimo, da če je količina kobalta, dostopnega v hrani, dovolj velika, potem pride do citotoksičnih učinkov (Novak idr., 2013). V okviru projekta NANOSOST so na podganah testirali več vidikov toksičnosti kobalt feritnih nanodelcev. Rezultati so pokazali, da jih lahko uvrstimo med snovi, ki so malo strupene za zarodek, če so prevlečeni s silanom. Če pa so prevlečeni z zlatom, pa za zarodek niso strupeni (Borras, 2011). 7

15 3.5 NAVADNA SONČNICA (Helianthus annuus L.) Kot sem že v uvodu omenila, smo za poskusno rastlino izbrali sončnico, ki spada v družino nebinovk (Asteraceae). Gre za enoletnico. Več cvetov je združenih v košku. To je glavičasto socvetje, ki ga obdaja skupen ovojek iz več ovojkovih listov in predstavlja eno opraševalno enoto. Socvetje je lahko ali popolnoma sploščeno ali pa skoraj sploščeno. Široko je do 30 cm. Je gojena rastlina, ponekod celo podivjana (Martinčič idr., 2007). Je zelika z močnim steblom ter širokimi, jajčastimi, pecljatimi, s tremi dobro vidnimi žilami, napiljenimi, hrapavimi listi. Jezičasti cvetovi so svetlo ali intenzivno rumeni, lahko tudi rdečkasto rumeni. Obdobje cvetenja je v mesecih od julija do septembra (Bianchini in Pantano, 1981). Je uporabna oljnica, medovita, okrasna in krmna rastlina. Po videzu in biokemični sestavi semena se močno razlikuje od divje rastočih sončnic. Pridelana semena uporabljajo za hrano ptic in pridobivanje sončničnega jedilnega olja ter margarine. Latinsko ime Helianthus annuus L. izvira iz besede Helios, ki pomeni sonce, in besede Anthos, ki pomeni cvet (Kocjan Ačko, 2013). Njena prvotna domovina je Severna Amerika, danes pa je v Evropi pomemben vir jedilnega olja. Kot zanimivost naj navedem, da je potrebnih 60 rastlin, da dajo primerno število semen, iz katerih lahko iztisnejo liter olja (Spohn in Aichele, 2011). Sončnice so poleg topolov in vrb najpogostejša vrsta rastlin za čiščenje onesnaženih tal. Lahko se jih uporablja za rizofiltracijo. To je absorpcija onesnaževalcev iz kontaminirane zemlje v korenine rastlin. Hkrati pa se s tem načinom čisti tudi podtalnice. Po nesreči v nuklearni elektrarni v Černobilu, v Ukrajini, so sončnice uporabili za uspešno odstranjevanje radioaktivnega urana iz vode. Pogosto se jih uporablja tudi pri fitoekstrakciji, in sicer se tla, sedimente, razna onesnažena industrijska območja, ki so onesnažena z onesnaževalci, kot so kovine (Pb, Cd, Zn, Ni, Cu) z dodatkom EDTA tudi Pb in Se, uspešno očisti (Sajovic, 2010). 8

16 Slika 1: navadna sončnica (Helianthus annuus L.) 4. MATERIAL IN METODE 4.1 PRIPRAVA POSKUSA Semena sončnic smo kalili v substratu Agra-vermikulit (RHP). Po enem tednu smo jih prenesli na hidroponiko, kjer so rasle dva tedna v hranilni Hoglandovi raztopini. Pripravili smo jo tako, da smo zmešali: 50 ml 0,5 M Ca(NO3)2, 50 ml 0,5 M KNO3, 20 ml 0,5 M MgSO4, 10 ml 0,5 M KH2PO4, 10 ml EDTA, 10 ml mikroelementov, 10 L destilirane vode. 9

17 Zaradi zanesljivejših rezultatov smo v vsako - s hranilno raztopino napolnjeno - čašo položili stiroporni plovec s tremi enako velikimi kalicami sončnice. V rastni komori smo rastline gojili tako, da smo vsako čašo prepihovali z zrakom po cevki, ki je bila povezana z zračno črpalko. V vseh čašah smo 1x tedensko zamenjali hranilno Hoglandovo raztopino. Imeli smo 16 čaš, ki so bile ovite v črn plastificiran papir. Po štirinajstih dneh smo začeli s tretiranjem z ustreznimi koncentracijami kobaltovega klorida in kobalt feritnih nanodelcev, in sicer 1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l kobalta v kobaltovem kloridu (CoCl2) in 1 mg/l, 10 mg/l, 100 mg/l kobaltovega ferita (CoFe2O4). Te pripravljene raztopine smo tedensko menjali. Za vsako koncentracijo smo pripravili dve paralelki (dve čaši za vsak tretma). Uporabili smo tudi kontrolno skupino, ki je rasla samo v destilirani vodi. Po štirih tednih smo zaključili tretiranje. Slika 2: rastline, gojene v rastni komori 4.2 MERJENJE FOTOKEMIČNE UČINKOVITOSTI FOTOSISTEMA II (FS II) Za merjenje fotokemične učinkovitosti fotosistema II (FS II) smo uporabili modulacijski fluorometer OS-500 (Opti-Sciences). Dejansko fotokemično učinkovitost fotosistema II (FS II) smo merili pri danih svetlobnih pogojih. Na liste smo pritrdili ščipalke, tako da so bili osvetljeni s saturacijskim pulzom bele svetlobe. Nato smo na aparatu odčitali dejansko fotokemično učinkovitost fotosistema II (FS II). Pred merjenjem potencialne fotokemične učinkovitosti fotosistema II (FS II) smo na liste pritrdili ščipalke za temotno adaptacijo. Po 20 minutah adaptacije smo liste osvetlili s pulzom bele svetlobe in na napravi odčitali vrednosti potencialne fotokemične učinkovitosti fotosistema II (FS II). 10

18 Slika 3: merjenje fotokemične učinkovitosti fotosistema II (FS II) 4.3 PRIPRAVA RASTLIN ZA MERITVE (sveža, suha masa) Rastline smo vzeli iz raztopin in ločili poganjke od korenin. Nato smo jih stehtali in tako dobili svežo maso. Po tehtanju smo poganjke in korenine zavili v aluminijasto folijo in jih zamrznili v tekočem dušiku. Potem smo zamrznjene rastline posušili v liofilizerju. Po končanem liofiliziranju smo ponovno stehtali (suho maso) poganjke in korenine. Tako smo dobili rezultate vsebnosti vode v sončnicah. 4.4 PRIPRAVA VZORCEV ZA MERJENJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV S pomočjo tekočega dušika smo posušeni rastlinski material uprašili v terilnici. 11

19 Slika 4: priprava vzorcev Nato smo s pomočjo tehtnice v čiste centrifugirke natehtali 30 mg poganjkov. Temu smo dodali 5 ml 80-odst. acetona in vzorce premešali na vorteksu. Centrifugirke smo nato pokrili z gumijastimi pokrovčki, označili višino acetona in jih postavili za čez noč v hladilnik. Prihodnji dan smo po potrebi dodali do označene višine 80-odst. aceton, vzorce ponovno dobro zvorteksirali in jih tri minute centrifugirali na 2500 obratih/ minuto. Slika 5: mešanje vzorcev na vorteksu Na koncu smo na spektrofotometru 8452A (HP-Hewlett Packard) pomerili absorpcijo pri treh valovnih dolžinah, in sicer 647 nm, 664 nm in 470 nm. Spektrofotometer smo umerili z 80-12

20 odst. acetonom. Iz dobljenih absorpcij smo izračunali koncentracije pigmentov v enotah µmol/l po spodaj zapisanih enačbah za klorofil a, klorofil b ter karotenoide (Lichtenthaker, 1987). chl = 13,19 A 2,57 A...(1) chl = 22,10 A 5,26 A...(2) karotenoidov ( ) = *+++, -./0*, , (3) *81 x ( : ) = ; <3 =>?@ABCD E AFGCHDFCD : =I?DBJFIK *+++...(4) 4.5 STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV Pridobljene podatke smo analizirali s standardnimi statističnimi metodami. Pri tem smo si pomagali z MS Excel 2013 in programskim kompletom Statistica (Statsoft EN). Za izračun statistično značilnih razlik pa smo uporabili program enosmerna ANOVA, Duncanov test (p < 0,05). 5. REZULTATI 5.1 ANALIZA FOTOKEMIČNE UČINKOVITOSTI FOTOSISTEMA II (FS II) Statistično značilne razlike se opazijo pri potencialni in dejanski fotokemični učinkovitosti fotosistema II (FS II) na rastlinah, tretiranih s kobaltovim feritom (CoFe2O4) in kobaltovim ionom (Co 2+ ). V vseh primerih je vidno zniževanje potencialne in dejanske fotokemične učinkovitosti fotosistema II (FS II) z višanjem koncentracij. Potencialna fotokemična učinkovitost fotosistema II (FS II) ni bila nikoli nižja od dejanske fotokemične učinkovitosti fotosistema II (FS II) (slika 6 in slika 7). Potencialna fotokemična učinkovitost fotosistema II (FS II) pri tretiranju z 10 in 100 mg/l CoFe2O4, ter 1, 10, 100 mg/l Co 2+ je bila statistično značilno manjša od potencialne fotokemične učinkovitosti fotosistema II (FS II) kontrolnih rastlin. Rastline, ki so bile tretirane z 1 mg/l CoFe2O4, niso vplivale na potencialno fotokemično učinkovitost fotosistema II (FS II) (slika 6 in slika 7). 13

21 Dejanska fotokemična učinkovitost fotosistema II (FS II) se je statistično značilno zmanjšala v primerjavi s kontrolo pri rastlinah, tretiranih z 1, 10 in 100 mg/l CoFe2O4, ter 10, 100 mg/l Co 2+. Pri tretiranju z 1 mg/l Co 2+ ni bilo statistično značilnega vpliva na dejansko fotokemično učinkovitost fotosistema II (FS II) (slika 6 in slika 7). 0,90 0,80 0,70 a A a B b BC b C Fotokemična učinkovitost 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 Potencialna FS II Dejanska FS II 0,10 0, Koncentracija CoFe 2 O 4 (mg/l) Slika 6: Fotokemična učinkovitost fotosistema II (FS II) pri različnih tretmajih s kobaltovim feritom (povprečje ± standardna napaka, N = 6). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05). 14

22 0,90 Fotokemična učinkovitost 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 a A b A c B d C Potencialna FS II Dejanska FS II 0,10 0, Koncentracija Co 2+ (ppm) Slika 7: Fotokemična učinkovitost fotosistema II (FS II) pri različnih tretmajih s kobaltovim kloridom (povprečje ± standardna napaka, N = 6). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05). 5.2 SUHA MASA RASTLIN Je pokazala, da so različne koncentracije kobaltovega ferita in kobaltovega klorida v raztopinah vplivale tako na suho maso poganjkov kot tudi na suho maso korenin. V vseh primerih značilnih razlik je bil vpliv negativen (slika 8). Masa poganjkov je bila večja od mase korenin. Masa poganjkov rastlin, tretiranih z 100 mg/l Co 2+, ter 100 mg/l CoFe2O4 je bila statistično značilno manjša od mase kontrolnih rastlin. Rastline, ki so bile tretirane z 1, 10 mg/l Co 2+ ter 1, 10 mg/l CoFe2O4, niso statistično značilno vplivale na maso poganjkov (slika 8). Pri koreninah se je masa statistično značilno zmanjšala v primerjavi s kontrolo le pri rastlinah, ki so bile tretirane s 100 mg/l Co 2+ ter 100 mg/l CoFe2O4. Pri tretiranju z 1, 10 mg/l Co 2+ ter 1, 10 mg/l CoFe2O4 ni bilo statistično značilnega vpliva na maso korenin. Opazili smo težnjo večjega zmanjšanja biomase korenin pri rastlinah, ki so bile tretirane s Co 2+ (slika 8). 15

23 2,50 A 2,00 AB A AB Suha masa (g) 1,50 1,00 0,50 a ab ab AB b B a ab AB B Suha masa korenin Suha masa poganjkov 0,00 ab b Koncentracija (ppm) Slika 8: Suha masa poganjkov in korenin sončnic pri različnih tretmajih (povprečje ± standardna napaka, N = 6). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05). 5.3 KONCENTRACIJA FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV V vseh tretiranih rastlinah je bila najvišja koncentracija klorofila a, temu pa je sledil klorofil b. Kobaltov ferit ima statistično večji vpliv na fotosintezne pigmente kot pa Co 2+. Faktorska analiza variance je pokazala, da sta na koncentracijo klorofila b vplivala tako kobaltov ferit kot tudi Co 2+, medtem ko je na klorofil a vplival samo kobaltov ferit (slika 9). Koncentracija klorofila a se statistično značilno znižuje pri poganjkih, tretiranih s 100 mg/l CoFe2O4. Pri tretiranju z 1, 10 mg/l CoFe2O4 ter 1, 10, 100 mg/l Co 2+ ni bilo statistično značilnega vpliva na klorofil a. Koncentracija klorofila b se je statistično značilno zmanjšala v primerjavi s kontrolo pri rastlinah, tretiranih z 10, 100 mg/l CoFe2O4. Pri tretiranju s 100 mg/l Co 2+ pa se je koncentracija klorofila b povečala. Koncentracija klorofila b se pri tretiranju z 1 mg/l CoFe2O4 ter 1 in 10 mg/l Co 2+ ni statistično značilno spremenila (slika 9). 16

24 3,50 Koncentracija pigmentov (mg/g) 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 a ab ab bc c a ab AB AB ab b ab B B AB ab AB c ab A d Klorofil a Klorofil b Razmerje chl a/chl b Koncentracija (mg/l) Slika 9: Fotosintezni pigmenti pri različnih tretmajih (povprečje ± standardna napaka, N = 6). Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med tretmaji (enosmerna ANOVA, Duncanov test, p<0,05). 6. DISKUSIJA 6.2 FOTOKEMIČNA UČINKOVITOST FOTOSISTEMA II (FS II) Rastline so lahko podvržene različnim stresnim dejavnikom, ki posledično omejujejo njihovo rast in razvoj, obenem pa prikazujejo njihovo fiziološko stanje. Stres se pojavi takrat, ko so rastline izven meja idealnih razmer (Larcher, 2001). Fotokemična učinkovitost fotosistema II (FS II) služi kot pokazatelj pojavljanja stresa pri rastlinah. Teoretične vrednosti potencialne fotokemične učinkovitosti fotosistema II (FS II) se gibljejo okoli zgornje meje 0,83 (Schreiber, Bilger in Neubauer, 1995). Kadar je rastlina pri potencialni fotokemični učinkovitosti fotosistema II (FS II) izpostavljena stresu, ne dosega vrednosti 0,83-0,85 (Trošt Sedej, 2005). Naša analiza potencialne in dejanske fotokemične učinkovitosti fotosistema II (FS II) nam je pokazala, da so bile rastline v času rasti izpostavljene stresu, ker so vrednosti pod 0,8. Dejanska fotokemična učinkovitost fotosistema II (FS II) je bila vedno enaka ali manjša od potencialne fotokemične učinkovitosti fotosistema II (FS II). Rastline, ki so rasle v raztopini s kobaltovim feritom, so imele manjše zmanjšanje dejanske in potencialne fotokemične učinkovitosti fotosistema II (FS II) kot rastline, ki so rasle v raztopini s Co 2+. Od 17

25 rezistence, trajanja, pogostosti izpostavitve, kombinacije stresorjev in organa, razvojne faze ter občutljivosti rastline je odvisno, ali bo stres vodil rastlino v smrt ali ne (Larcher, 2001). 6.3 SVEŽA, SUHA MASA RASTLIN Stres pri rastlini se kaže tudi v motnji rasti in zmanjšani tvorbi suhe mase (Larcher, 2001). Kobaltovi ioni, ki se sproščajo, imajo negativen vpliv na rast sončnic. V naši raziskavi smo ugotovili, da so rastline slabše rasle v raztopinah kobaltovega ferita ter Co 2+ kot rastline, ki so rasle v destilirani vodi, kar se vidi iz rezultatov tehtanja suhe mase korenin in poganjkov. Novak idr. (2013) so ugotovili, da so Co 2+ ioni bolj strupeni kot nanodelci ter da je bila v primerjavi s kontrolnimi živalmi zmanjšana stopnja hranjenja živali, ki so bile izpostavljene Co 2+, kot pa CoFe2O4. Temu so podobni naši rezultati, ki kažejo, da so rastline, ki so rasle v raztopini s Co 2+, imele nižjo maso kot rastline, ki so rasle v raztopini s kobaltovim feritom (CoFe2O4). Toksični učinek kobalta se veča z višanjem koncentracije in s tem vpliva na zmanjšanje velikosti listov, zaviranje ozelenitve ter zmanjšano maso (Palit idr., 1994). To smo ugotovili tudi v našem poskusu, kjer je bila vidna razlika med kontrolo in rastlinami, tretiranimi z 100 mg/l CoFe2O4, 100 mg/l Co FOTOSINTEZNI PIGMENTI Zaradi stresa je zmanjšana fotosinteza (Larcher, 2001). Znano je, da Co 2+ zmanjšuje izvoz fotoasimilacije in fiksacije CO2. Spremeni se delovanje endo in eksonukleaz (Palit idr., 1994). Ursache-Oprisan idr. (2011) so ugotovili, da CoFe2O4 zavira delovanje kompleksa II (LHC II) iz kloroplasta membran in s tem vpliva na zmanjšanje koncentracij klorofilov. To smo potrdili z našim poskusom, kjer je bilo opaziti, da se je znižala koncentracija klorofila a pri poganjkih, tretiranih s 100 mg/l CoFe2O4. Prav tako se je klorofil b znižal pri rastlinah, tretiranih z 10 in 100 mg/l CoFe2O4. To nakazuje, da bi lahko kobaltov ferit znižal fotosintezno aktivnost. Nasprotno od CoFe2O4 je deloval Co 2+, ki ni imel večjega vpliva na koncentracijo klorofila, medtem ko je povišal koncentracijo klorofila b pri rastlinah, tretiranih z 100 mg/l Co 2+. To kaže na to, da Co 2+ ni imel negativnega učinka na fotosintezo. 18

26 7. SKLEPI S tem poskusom smo dokazali, da so bile sončnice, ki so bile tretirane z različnimi koncentracijami kobaltovega ferita in Co 2+ v primerjavi s kontrolo, pod stresom. Zaradi tega so imele nižjo potencialno in dejansko fotokemično učinkovitost fotosistema II (FS II), manjšo suho maso in nižje koncentracije klorofila a in b. Izjeme so bile samo pri koncentracijah klorofila b, kjer je bilo opaziti pozitiven Co 2+ učinek. Razlog je v premajhnem vzorcu rastlin in potrebno bi bilo poskus ponoviti. Rastline, tretirane s kobaltovim feritom, so - v primerjavi s Co 2+ - bolje rasle in se razvijale. Z rezultati smo potrdili hipotezo, da bodo imele naraščajoče koncentracije kobaltovega ferita in Co 2+ negativen učinek na rast in razvoj rastline. Poleg tega pa drži tudi hipoteza, da se bodo pojavile spremembe pri mladih rastlinah sončnice, ki bodo rasle v hidroponski raztopini/suspenziji z različnimi koncentracijami kobaltovih ionov in nanodelcev kobaltovega ferita, v koncentraciji fotosinteznih pigmentov, suhi masi ter fotokemični učinkovitosti fotosistema II (FS II). Ugotovili smo, da kobaltovi feritni nanodelci negativno vplivajo na višje rastline in posledično lahko tudi na onesnaževanje zemlje, okolja in človekovo zdravje. 19

27 8. LITERATURA Bianchini, F. in Pantano, A. C. (1981). Vse o cvetju: vodnik za gojenje zelenja in cvetja. 4. ponatis. Ljubljana: Mladinska knjiga, 360. Borras, M. (2011). Nanotoxicology: challenges and future. Séminaires & Conférences Chimie École Doctorale 459. Drobne, D. (2007). Nanotoxicology for safe and sustainable nanotechnology. Archives of Industrial Hygiene and Toxicology, Gyergyek, S., Makovec, D. in Drofenik, M. (2008). Priprava Co-feritnih nanodelcev z ozko porazdelitvijo velikosti z metodo termičnega razpada oleatov. Materiali in tehnologije. 42, (6), Horev-Azaria, L., Kirkpatrick, C. J., Korenstein, R., Marche, P. N., Maimon, O., Ponti, J., Villiers, C. (2011). Predictive Toxicology of Cobalt Nanoparticles and Ions: Comparative In Vitro Study of Different Cellular Models Using Methods of Knowledge Discovery from Data. Toxicol. Sci., 122 (2), doi: /toxsci/kfr124 Larcher, W. (2001). Physiological Plant Ecology. Ecophysiology and Stress Physiology of Functional Groups. 4th Edition. Springer-New York, 513. Jayakumar, K. in Jaleel, C.A. (2009). Uptake and Accumulation of Cobalt in Plants: a Study Based on Exogenous Cobalt in Soybean. Botany Research International 2 (4), Kocjan Ačko, D. (2013). Sončnica, pomembna svetovna oljnica, medovita in okrasna rastlina. [PowerPoint]. Pridobljeno 8. julija 2015 s -lj.si/fileadmin/users/1/agronomija/katedra/soncnica_botanicni_vrt_ul_2013.pdf Li, H.F., Gray, C., Mico, C., Zhao, F.J. in McGrath, S.P. (2009). Phytotoxicity and bioavailability of cobalt to plants in a range of soils. Chemosphere, Lichtenthaker, H.K. (1987). Chlorophylls and carotenoids:pigments of photosynthetic biomembranes. Methods Enzym. 148, Martinčič, A., Wraber, T., Jogan, N., Podobnik, A., Turk, B. in Vreš, B. (2007). Mala flora Slovenije: ključ za določanje praprotnic in semenk. 4., dopolnjena in spremenjena izdaja. Ljubljana: Tehniška založba Slovenije, 633, Monica, R. C. in Cremonini, R. (2009). Nanoparticles and higher plants. Caryologia, 62, (3),

28 Novak, S., Drobne, D., Golobič, M., Zupanc, J., Romih, T., Gianoncelli, A., Makovec, D. (2013). Cellular Internalization of Dissolved Cobalt Ions from Ingested CoFe2O4 Nanoparticles: In Vivo Experimental Evidence. American Chemical Society, Palit S., Sharma, A. in Talukder, G. (1994). Effects of cobalt on plants. Stevenson, D.W., The Botanical Review, 60, (2), Pridobljeno s Papis, E., Rossi, F., Raspanti, M., Dalle-Donne, I., Colombo, G., Milzani, A., Gornati, R. (2009). Engineered cobalt oxide nanoparticles readily enter cells. ScienceDirect, 189, (3), Plant & soil Sciences elibrary. (2015). Pridobljeno 20. avgusta 2015 s &topicorder=7&maxto=10 Ponti, J., Colognato, R., Franchini, F., Gioria, S., Simonelli, F., Abbas, K., Rossi F. (2009). A quantitative in vitro approach to study the intracellular fate of gold nanoparticles: from synthesis to cytotoxicity. Nanotoxicology, Rana, S. in Kalaichelvan, P. T. (2013). Ecotoxicity of Nanoparticles. ISRN Toxicology, 1-9. Remškar, M. (2009). Nanodelci in nanovarnost. november: Ministrstvo za zdravje, Urad RS za kemikalije. Sajovic, A. (2010). Ekoremediacije. Pridobljeno 8. julija 2015 s Biotehniska_podrocja sole_za_zivljenje_in_razvoj/bt_podrocja_56naravov ARSTVO_Ekoremediacije_Sajovic.pdf Schreiber, U., Bilger, W. in Neubauer, C. (1995). Chlorophyll Fluorescence as a Nonintrusive Indicator for Rapid Assessment of In Vivo Photosynthesis. Schultze, E.D., Caldwell, M.M., Ecophysiology of Photosynthesis (str ). Pridobljeno s Spohn, M. in Aichele, D. (2011). Kaj neki tu cveti? Preddvor: Založba Narava d.o.o., 422. Trošt Sedej, T. (2005). Ekologija rastlin: priročnik za vaje. Ljubljana: Študentska založba. Ursache-Oprisan, M., Focanici, E., Creanga, D. in Caltun, O. (2011). Sunflower chlorophyll levels after magnetic nanoparticle supply. African Journal of Biotechnology, 10 (36),

29 Whatmore, R. W. (2006). Nanotechnology-what is it? Should we be worried? Occupational - Medicine, 56, doi: /occmed/kq

30 ZAHVALA Iskreno se zahvaljujem svoji mentorici prof. dr. Katarini Vogel Mikuš, ki mi je prijazno pomagala in svetovala pri pisanju diplomske naloge. Iz srca se ji zahvaljujem za ves trud in čas, ki mi ga je namenila; le z njeno pomočjo in znanjem je lahko nastalo to diplomsko delo. Zahvala gre tudi ostalima članicama komisije: prof. dr. Mateji Germ in prof. dr. Marjani Regvar za hiter pregled diplomske naloge in vse koristne napotke. Za pomoč pri laboratorijskem delu se zahvaljujem Špeli Kržišnik, za lektoriranje predmetni učiteljici slovenskega jezika in književnosti Marjanci Štern, Nini Hočevar pa za prevod povzetka v angleški jezik. Hvala tudi Ani Šalda, Tanji Murn in Manci Može za pravo prijateljstvo ter spodbudne besede. Največja zahvala pa gre članom moje družine. Hvaležna sem jim za vso podporo in ljubezen, ki mi jo ves čas izkazujejo. Brez njih mi nikoli ne bi uspelo. 23