UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ ŽIVILSKA TEHNOLOGIJA PROIZVODNJA AMINOKISLIN* Barbara KLOBČAR, Simon KODRIČ, Simona KOROŠEC, Klemen LISJAK (študentje tretjega letnika študija Živilske tehnologije) asist. Maja Paš, dipl. inž. in prof. dr. Peter Raspor (mentorja) Ljubljana, 2000 * Seminarska naloga pri predmetu Biotehnologija

2 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, POVZETEK Aminokisline se kot eden najpomembnejših produktov mikrobne biotehnologije najpogosteje pridobivajo s fermentacijo. Predstavljajo končni produkt biosintetske poti. Njihova hiperprodukcija je običajno preprečena z različnimi vrstami negativne regulacije. V organizmih kot je naprimer E. coli, ki živi v kompleksnem in nestalnem okolju so takšni mehanizmi lahko zelo otežkočeni. V nasprotju s temi pa je regulatorski mehanizem mikroorganizmov, ki živijo v enostavnem in stalnem okolju precej enostaven. Mnogi organizmi te vrste so iz skupine Brevibacterium Corynebacterium in se v veliki meri koristno uporabljajo fermentaciji. Vendar je tudi pri teh v večini primerov nujno potrebno preprečiti negativno regulacijo. To lahko dosežemo z inaktivacijo preko mutacije, enega od encimov biosintetske poti in tako odstranimo negativno kontrolo pri aminokislinah in produktu ter na ta način dosežemo kopičenje intermediatov pred oviro. Hiperprodukcijo minokislin lahko dosežemo tudi s spreminjanjem negativne regulacije; to je navadno doseženo s selekcijo mutantov, ki rastejo v prisotnosti analognih aminokislin, ki aminokisline posnemajo ali v povratni inhibiciji ali pa v represivnem procesu. Obstaja pa ena izjema; divja vrsta skupine Brevibacterium Corynebacterium proizvaja velike količine glutaminske kisline, vendar le pod vplivom posebnih pogojev. Pri tem celice uporabljajo α-ketoglutarat, ki se ob nizki koncentraciji kisika kopiči, za reoksidacijo nakopičenega NADPH. Glutamat je pri tem odvečni produkt katabolizma. Izločanje glutamata se poveča tudi ob pomanjkanju biotina, vendar je ta mehanizem slabo poznan. Trehnologija rekombinacije DNA ne predstavlja glavne vloge v fermentativnem pridobivanju aminokislin. To je le osnovni način, ker potrebujemo usklajeno hiperprodukcijo mnogih encimov in ker bi na ta način izčrpali metabolizem produktivnih organizmov tudi brez uporabe rekombinantne DNA. Nekatere aminokisline so pridobljene direktno z encimsko zamenjavo sestavljenih prekurzorjev. Fiziološko gledano navadno ti encimi delujejo, tako da razgradijo aminokisline, lahko pa so takšni, ki sintetizirajo, v primeru prisotnosti velike koncentracije reaktantov. Učinkovitost delovanja encimov je izboljšana z uporabo kolone z imobiliziranimi encimi.

3 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, SUMMARY Amino acids, some of the most important products of microbial biotehnology, are frequently produced by fermentation. As end products of biosintetic pathways, their over production is normaly prevented by various kinds og negative regulation. Such mechanisms can be complicated in organisms such as E. coli that live in a complex and fluctuating environment. In contrast, regulatory mechanisms are relatively simple in microorganisms that live in simple and constant evironments. Such species, many of which are members of the Brevibacterium Corynebacterium cluster, have been utilized widely in amino acid fermentation, though even with these organisms it is usually necessary to prevent negative regulation. This has been achieved by inacitvating, through mutation, One of the enzymes of the biosintetic pathway in order to eliminate negative control by the amino acid end product and thereby cause acumulation of the intermediate before the block. Alternatively, amino acids rather than the intermediates can be over produced by altering the machinery of negative regulation; this is usually achived by selecting mutants that grow in the presence of amino acid analogs, ehich mimic the amino acids in either the feedback inhibition or the repression process. In one exceptional case, wild-type strains in the Brevibacterium-Corynebacterium group produce large amounts of glutamic acid. This occurs only under special conditions, and apparently the cells use α-ketoglutarate, which accumulates when oxygen is low, to reoxidize the accumulated NADPH, generating glutamate is a waste product of catabolism. Glutamate excretion is enhanced by biotin deficiency through a poorly understood mechanism. Recombinant DNA technology has not played a major role in the fermentative production in of amino acids. This is primaly because it would require the coordinated over production of many enzymes and bacause it causes a major drain on the matabolism of the producing organism even without the use of recombinant DNA. However, with the construction of sutible vectors, recombinat DNA methods are likely to be introduced into an encreasing number of sistems. Some amino acids are produced by direct, enzymatic conversion of precursor compunds. Physiologically, these enzymes usually function to degrade amino acids, but they can also be made to sintetise aminoacid when the reactants are present in high concentrations. The efficiensy of the operation and the stability of the enzymes are improved ehen the enzymes (or, in some cases, cells containig the enzymes ) are imobilized in enzy columns.

4 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, KAZALO 1. ZGODOVINA PROIZVODNJE AMINOKISLIN PREDSTAVITEV AMINOKISLIN UPORABA AMINOKISLIN UPORABA AMINOKISLIN V HRANI UPORABA AMINOKISLIN V ŽIVALSKI KRMI UPORABA AMINOKISLIN V FARMACIJI IN DRUGIH TEHNOLOGIJAH METODE PRIDOBIVANJA AMINOKISLIN PROIZVODNJA AMINOKISLIN, KI SE PRETEŽNO UPORABLJAJO V ŽIVILSKI INDUSTRIJI PROIZVODNJA GLUTAMINSKE KISLINE UVOD ZGODOVINA BIOPROCESA MIKROBIOLOŠKE OSNOVE BIOPROCESA BIOKEMISJKE OSNOVE BIOPROCESA REGULACIJA ENCIMOV VPLETENIH V SINTEZO GLUTAMATA MEHANIZEM IZLOČANJA GLUTAMATA IZ CELIC VLAGA BIOTINA V DIREKTNI FERMENTACIJI BIOINŽENISRKE OSNOVE BIOPROCESA IMPLIKACIJA V DRUGE VEDE PROIZVODNJA AMINOKISLIN, KI SE PRETEŽNO UPORABLJAJO V PROIZVODNJI ŽIVALSKE KRME PROIZVODNJA LIZINA BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA MIKROBIOLOŠKE IN BIOINŽENIRSKE OSNOVE BIOPROCESA PRIPRAVLJALNI POSTOPKI IZVOR OGLJIKA POTREBNE SOLI AERACIJA ph in TEMPERATURA KONČNI POSTOPKI PROIZVODNJA AMINOKISLIN, KI SE PRETEŽNO UPORABLJAJO V FARMACEVTSKI IN KOZMETIČNI INDUSTRIJI PROIZVODNJA ALANINA BIOKEMIJSKA SINTEZA ALANINA MIKROBIOLOŠKA SINTEZA ALANINA PROIZVODNJA PROLINA BIOKEMIJSKA SINTEZA PROLINA MIKROBIOLOŠKA SINTEZA PROLINA ZAKLJUČEK REFERENCE... 30

5 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, ZGODOVINA PROIZVODNJE AMINOKISLIN Začetki industrijske proizvodnje aminokislin segajo v leto Takrat se je japonski agronomski kemik K. Ikeda odkril, da značilen okus hrani kuhanim s suhim lososom, ki je na Japonskem zelo cenjen, daje L-glutamat. Na začetku 50 let 20. stoletja je proizvodnja mononatrijevega L -glutamata temeljila na kislinski hidrolizi proteinov. Ta kemični postopek je bil zelo drag, zaradi potrebne izolacije glutamata od ostalih aminokislin v hidrolizatu. Pomembno odkritje je bila kemična sinteza mononatrijevega L-glutamata (MSG). Vendar je tudi ta proces predstavljal velik strošek, zaradi proizvodnje mešanice D- in L- glutamata, ki sta morala biti raztopljena, da so lahko izločili D-izomero. Leta 1957 je bila predstavljena revolucionarna sprememba, ko je znanstvenik Kyowa Hakko Co. odkril bakterijo, ki izloča velike količine L-glutamata v gojišče. Kmalu za tem so podobno bakterijo izolirali tudi druge družbe in so jo uporabljali v novi industrijski tehnologiji: aminokislinski fermantaciji, proizvodnji aminokislin z mikroorganizmi. Razen etanola in nekaterih drugih organskih topil ter nekaterih vitaminov je glutamat prva organska komponenta proizvedena na industrijski način s tehniko mikrobne fermentacije. Danes mnoge aminokisline izdelujejo ali s fermentacijo ali pa s sorodnimi postopki, ki temeljijo na imobiliziranih encimskih kolonah. Leta 1997 je bila vrednost proizvodnje aminokislin ocenjena na 1,9 milijona dolarjev na leto. Aminokisline so tako količinsko najbolj pomembni produkti mikrobne biotehnologije, takoj za etanolom in antibiotiki. 2. PREDSTAVITEV AMINOKISLIN Aminokisline so organske spojine, ki vsebujejo najmanj eno amino skupino in eno karboksilno funkcionalno skupino ter radikal R, ki je vezan na α C atom. Radikal je lahko nepolarni, polarni, negativno nabit ali pozitivno nabit. DELITEV AMINOKISLIN: aminokisline z nepolarnimi, hidrofobnimi radikali: alanin (Ala) valin (Val) levcin (Leu) izolevcin (Ile) fenil alanin (Phe) triptofan (Trp) prolin (Pro) metionin (Met) Aminokisline s polarnimi radikali brez naboja (ph 6,0-7,0) serin (Ser) treonin (Thr) tirozin (Tyr) cistein (Cys) glicin (Gly) asparagin (Asn) glutamin (Gln)

6 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Aminokisline z negativno nabitim stranskim radikalom (ph 6,0-7,0) aparaginska kislina (Asp) glutaminska kislina (Glu) Aminokisline s pozitivno nabitim stranskim radikalom (ph 6,0-7,0) lizin (lyz) arginin (Arg) histidin (His) Aminokisline so optično aktivne, imamo dve obliki L in D izomero. So osnovni gradnik peptidov in proteinov; približno 20 L-aminokislin, 8 od teh je esencialnih za sesalce. D- enantiomere ravno tako kot L-enantiomere služijo kot metaboliti v celičnih stenah bakterij, v peptidnih antibiotikih in rastlinah. 3. UPORABA AMINOKILSIN Aminokisline so uporabne na več področjih: 1. V hrani se uporabljajo kot prehranski superelementi; lizin, triptofan in treonin se uporabljajo za obogatitev rastlinskih proteinov, metionin za obogatitev sojinih jedi. 2. V predelavi hrane služijo za ojačevalce arom in kot aditivi; L-enantiomera MSG je uporabna zaradi njegovega mesnega okusa, medtem ko se glicin uporablja kot sladilo, bakteriostatsko sredstvo in antioksidant. 3. V zdravstvu jih uporabljajo v terapevtske namene v infuzijah ali lahko tudi kot psihoterapevtska sredstva. 4. V farmacevstki in kemični industriji so široko uporabni kot prekurzorji za izdelavo detergentov poliaminskih kislin in kot organske kemikalije. 5. V živalski krmi za obogatitev le-te UPORABA AMINOKISLIN V HRANI Prehranska vrednost hrane ni odvisna samo od kalorične vrednosti, ampak tudi od vsebnosti, vrste in kvalitete aminokislin (tudi od vitaminov, mineralov in drugih mikroelementov). Veliko esencialnih aminokislin (lizin, metionin) se uporablja kot aditive; dodatek žitnim proteinom s premajhno vsebnostjo lizina ali za izboljšanje živalske krme revne z aminokislinami, ki vsebujejo žveplo. Ostale aminokisline kot sta na primer glutamat in glicin so uporabne kot ojačevalci naravnega okusa hrane. Po podatkih FAO je bilo leta 1974 porabljenih približno 96 milijonov ton proteinov. 65 % od teh je bilo pridobljenih iz rastlinskih virov; sem spadajo tudi proteini mesa in jajc, ki so navkljub živalskemu izvoru produkt porabe rastlinskih proteinov. Le-ti so tudi pomembni izvor limitirajočih aminokislin in so potemtakem dobrodošel dodatek rastlinski krmi oziroma hrani. V tem kontekstu so pomembni lizin, triptofan in treonin. Kot primer, če koruzno moko obogatimo z 0,4 % lizina x HCL ali z 0,4 % lizina in 0,07 % triptofana se vrednost za rast poveča iz 0,58 na 1,08 oziroma na 2,55.

7 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Tudi v živilski tehnologiji so v uporabi mnogokatere aminokisline med katerimi je danes najbolj v uporabi MSG s funkcijo aditiva oziroma ojačevalca okusa. Njegova poraba je v velikem porastu; iz ton MSG v letu 1970 je proizvodnja do leta 1980 narasla do približno ton. Glutamat ima mesni priokus in prspeva k večjemu izražanju že prisotnih arom živila; ta učinek je znatnejši pri L-enantiomeri kot pri D-enantiomeri. Le tega pripisujejo stimulativnemu delovanju na okušalne receptorje in se sinergistično poveča ob dodatku 5-inozinata ali 5-gvanilata. Tako ima mešanica iz 88 % MSG in 12 % inozinata 6 krat večji učinek kot enaka količina samega glutamata. Glicinu pripisujejo osvežilni sladek okus. V živilstvu se je pričel uporabljati kot sladilo pri pripravi nekaterih pijač t.i.»soft drinks«. Ima znaten bakteriostatični učinek, verjetno zaradi inhibitornega delovanja na biosintezo celične stene nekaterih bakterij (Bacillus subtilis). Poleg tega se glicin uporablja kot antioksidant za emulgatorje kot so mono- ali digliceroli. Učinkovito sredstvo proti porjavenju pa je cistein, ki se ga zaradi svojega redukcijskega učinka s pridom uporablja v pekarstvu za izboljšanje kvalitete končnih izdelkov (tvorba disulfitnih mostov in nastanek čvrstejše mrežaste strukture vzhajanih pekarskih izdelkov). Veliko DL-metionina se uporabi tudi za povečanje nutricijske vrednosti živil; tako je poraba aminokislin v 8 letih do leta izdaje knjige (1983) narasla za kar 8 krat. Najpomembnejši izvori beljakovin so ribje meso in soja UPORABA AMINOKISLIN V ŽIVALSKI KRMI Zelo pomembna in še vedno v porastu je uporaba aminokislin za prehrano monagastričnih živali. Polovico teh, ki gradijo proteine je esencialnih za živali (prašiči, perutnina). Proteini naravne krme iz rib, soje, koruze in pšenice so revni z metioniom, lizinom in treoninom. Zato so potrebe po teh pri živalih sorazmerno velike. Proizvajalec je tisti, ki mora zagotoviti njihovo zadostno količino v krmi. To lahko doseže na dva načina: s povečanjem količine proteinov v krmi z minimalno količino naravnih proteinov in superelemntov s katerimi lahko priskrbi primerne količine DL-metionina, L-lizina in L-treonina. Glede na to, da je proizvodnja teh aminokislin relativno poceni je druga metoda ugodnejša. Poleg tega pa z zmanjševanjem vsebnosti končnih proteinov v surovinah za krmo pomaga pri zmanjševanju okoljevarstvenih problemov, kot je na primer vzdrževanje sestave prašičjega gnoja. Poleg že omenjenih aminokislin je kot dodatek in limitirajoča aminokislina zelo pomemben tudi triptofan, predvsem v krmi iz žitaric. Vendar pa je ta še vedno predrag, da bi bila njegova uporaba kot dopolnilo krmi redna.

8 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, UPORABA AMINOKISLIN V FARMACIJI IN DRUGIH TEHNOLOGIJAH Aminokisline so uporabne tudi v terapevtske namene. Mešanica različnih aminokislin skupaj s sladkorji, vitamini in minerali se uporablja za infuzijske raztopine in za nekatera druga zdravila. Arginin oziroma njegova sol z aspartatom ali glutamatom je učinkovit pri motnjah v delovanju jeter. Proti utrujenosti, za oslabljeno srce, bolezni jeter in diabetes je uporaben kalij- magnezijev aspartat. Cistein varuje SH-encime v jetrih in vrsto drugih encimov pred oksidacijo ali inaktivacijo. Svojo zgradbo merkapto kislinskih derivatov, tioetrov v kombinaciji s fenolno hidroksilno skupino in s pretvorbo cianidov v tiocianide kažejo tudi detoksifikacijski učinek. Cistein ščiti tudi pred poškodbami sevanja. Dihidroksifenilalanin in D-fenilalanin sta učinkovita pri zdravljenju Parkinsonove bolezni, aminokislinki nadomestki kot je 5-hidroksi-L-triptofan pa se uporabljajo v psihoterapevtske namene. Poleg tega pa so odkrili tudi novo umetno sladilo L-apsartil-Lfenilalanin metilester, ki je 150 krat slajši od glukoze. Aminokisline so tako dobre kot proteini v zaščiti kože in se uporabljajo v kozmetiki za kožo in lase. Ostale zanimive fizikalno-kemijske lastnosti kot so termična stabilnost, nizka hlapnost, kelatne sposobnosti, nizka toksičnost, biorazgradljivost so razlog za vrsto različnih možnosti uporabe v kemijski industriji. 4. METODE PRIDOBIVANJA AMINOKISLIN Za pridobivanje aminokislin se uporabljajo naslednji postopki: ekstrakcijske metode encimske metode metode s kemijsko sintezo fermentacijske metode 1. EKSTRAKCIJSKA METODA Določeno aminokislino lahko iz proteinskega hidrolizata izločimo le, če se ta dovolj razlikuje od ostalih aminokislin v hidrolizatu, po svojih fizikalno-kemijskih lastnostih. Tako se lahko dobi in loči frakcije cisteina in tirozina. 2. ENCIMSKA METODA Aminokisline je mogoče pridobiti s pomočjo encimov mikroorganizma, pri čemer se uporablja del encimatskega preparata. L-asparginska kislina se tako pridobiva z uporabo suspenzije Echerichia coli. Reakcija je katalizirana v celicah mikroorganizmov s pomočjo aspartaze. Iz te se nato pridobiva industrijski L-alanin s pomočjo aspartat β-dekarboksilaze, z uporabo celic Psevdomonas dacunhae. Da pa bi se encimska reakcija odvijala do konca neprekinjeno je razvita tehnika imobilizacije celic mikroorganizmov z visoko encimsko aktivnostjo, z vgrajevanjem v polimerne nosilce.

9 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Iz cikloheksana, ki je vzporedni produkt kaprolaktama, se pridobiva DL-αaminokaprolaktam, ki se s posebnim postopkom pretvarja v L-lizin. Istočasno pa poteka izgradnja D-α-aminokaprolaktama in ta se pod vplivom α-amonokaprolaktam racemaze pretvarja v DL-α-aminokaprolaktam. 3. METODA S KEMISJKO SINTEZO Že prej smo omenili, da se s kemijsko sintezo pridobivajo racemne aminokisline, kar je pomanjkljivost te metode. Za pridobite optično aktivnih D- in L- enantiomer je potrebna njuna ločba. Zato se uporabljata dva postopka: encimski in kristalizacijski. Kristalizacisjki postopek temelji na principu lažje oziroma hitrejše kristalizacije optično aktivne izomere iz prenasičene raztopine aminokislinskega racemata, ob dodatku male količine željene izomere. Na ta način se danes pridobiva malo aminokislin. V določenih primerih je možna ločba izomer z njihovo pretvorbo v soli ali druge derivate. 4. FERMANTACIJSKA METODA Poznano je da različni mikroorganizmi, z nekaterimi izjemami sintetizirajo aminokisline na podoben, skoraj enak način. Istočasno pa so v regulaciji biosinteze različnih vrst velike razlike in odstopanja. Kontrola regulacije na nivoju sinteze encima katalizira specifična pot biosinteze (represija, derepresija). Mikroorganizmi sposobni preobilne sinteze aminokislin morajo imeti porušen kontrolni sistem ali kakšne druge»defekte«, ki zamenjajo normalen tok biosinteze. V nekaterih primerih te mikroorganizme srečamo v naravi (proizvajalci glutaminske kisline, alanina in valina). Cel niz ostalih aminokislin pa je nemogoče dobiti po mikrobiološki poti brez mutacij sistema njihove biosinteze. AUKSOTROFNI MUTANTI v velikih količinah proizvajajo samo eno aminokislino. To so mutanti, ki jim manjka eden ali več encimov za biosintezo določene aminokisline. S kopičenjem aminokislin ob pomoči auksotrofnih in regulatornih mutantov je danes mogoče dobiti industrijske seve, proizvajalce aminokislin. Tabela 1: Kopičenje aminokislin s pomočjo auksotrofnih mutantov Proizvod Primanjkljaj Mikroorganizem ornitin citrulin Corynebacterium glutamicus lizin homoserin, treonin + metionin citrulin arginin Bacillus subtilis valin levcin Corynebacterium glutamicus treonin metionin + izolevcin + DPK Escherichia coli Za izvor ogljikovih hidratov v fermentacijskem postopku se lahko uporablja: melaso, sladkorni trs, ocetno kislino, alkohol in nižje ogljikovodike. V sterilne fermentatorje, kjer se nahaja hranljiva podlaga z vitamini in mineralnimi solmi, ob primernem ph, se doda kultura mikroorganizmov. Nato se v to brozgo vodi amoniak in sterilen zrak ob stalnem mešanju. Optimalna temperatura je odvisna od seva mikroorganizmov in se običajno giblje med 26 in 28 C.

10 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Tabela 2: Proizvodnja aminokislin v svetu (1979) Aminokislina Metoda pridobivanja Uporaba Letna proizvodnja [t] Cena [US $/kg] L-glutaminska F začimbe ,4 kislina DL-metionin S dodatek krmi ,5 L-lizin F,E dodatek krmi ,0 L-izolevcin F infuzija ,0 glicin S sladilo ,5 L-glutamin F terapevtsko sred ,0 L-triptofan E,S infuzija ,0 L-cistein Ex dodatek kruhu, ,0 antioksidant L-arginin F infuzija, ,0 terapevstko sredstvo L-histidin F terapevstko ,0 sredstvo L-prolin F infutija ,0 L-treonin F,S dodatek krmi ,0 L-fenilalanin F,S infuzija ,0 L-valin F,S infuzija ,0 L-alanin E arome ,0 L-serin F,S kozmetika ,0 L-metionin E,S terapevstko ,0 sredstvo L-levcin F,Ex infuzija ,0 L-citrulin F terapevstko ,0 sredstvo L-tirozin Ex infuzija ,0 L-aspargin Ex, S terapevstko 50 40,0 sredstvo L-ornitin F terapevstko 50 40,0 sredstvo L-aparaginska E terapevstko 250 4,8 kislina sredstvo, arome β-alanin S dodatek krmi ,1 DL-alanin S arome 700 4,7 Skupaj F... fermentacijska metoda E... encimatska metoda Ex... ekstrakcijska metoda S... sinteza

11 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, PROIZVODNJA AMINOKISLIN, KI SE PRETEŽNO UPORABLJAJO V ŽIVILSKI INDUSTRIJI 5.1. PROIZVODNJA GLUTAMINSKE KISLINE UVOD Glutamainska kislina je najbolj razširjena in najbolj pomembna amino kislina v proteinih in peptidih. Vsa proteinsko bogata hrana npr. meso, ribe, sir, mleko, nekatera zelenjava vsebuje glutamat. Glutaminska kislina se v telesu lahko sama sintetizira in je nujno potrebena pri metabolizmu in delovanju možganov. V začetku stoletja so znanstveniki izolirali glutamat iz rastlin, ki je glavna komponenta, odgovorna za izredno povečanje okusa. V prvi polovici tega stoletja je bil Na-glutamat, natrijeva sol glutaminske kisline, ekstrahiran iz morske trave in drugih rastlinskih virov. Danes se glutamat v večini držav pridobiva skozi fermentacijski proces iz melase, to je lahko iz sladkorja škroba, itd. Na-glutamat (ang. Monosodium L-glutamat: MSG) ima okus po mesu in v kombinaciji z nukleotidi deluje kot ojačevalec okusa. Trenutna svetovna poraba Na-glutamata je 800,000 ton. Na ta način je to amino kislina z največjo produkcijsko kapaciteto ZGODOVINA BIOPROCESA Že dolgo časa je poznano, da nekateri mikroorganizmi v času rasti izločajo majhne količine aminokislin. Ker se je potreba po amino kislinah s časom zelo povečevala, je raziskovalce silila v nek novi vir pridobivanja; tako je leta 1958 japonski avtor Kinoshita s sod., prvič opazil mikroorganizem, pod nazivom Micrococcus glutamicus ki je neposredno tvoril L- glutaminsko kislino. Pred tem pa je proizvodnja glutamata potekala s pomočjo hidrolize proteinov, zato je prav, da se za primerjavo dotaknemo tudi tega procesa. Problem hidrolize je namreč vir in količina izhodnega materiala. Največ glutaminske kisline vsebuje čisti pšenični gluten, okrog 35%. Vendar pa je vsebnost glutena v pšenici od 8,6 do 17,2 %. Drugi vir je bil koruzni gluten, le da ta vsebuje manjši % glutena. V glavnem sta se uporabljala dva tipa proizvodnje glutaminske kisline, odvisno pač ali je bila glutaminska kislina pridobljena najprej kot hidroklorid ali kot kislina sama. V obeh primerih pa je hidroliza potekala v avtoklavu v prisotnosti 34% HCL, visoke temperature in tlaka. Sledila je kristalizacija, filtracija in koncentriranje. Kinoshita je torej prvi opazil, da je večina celic zraslih na agarju okroglaste ali jajčaste oblike in so zelo blizu rodu Micrococcus, od tod so ti mikroorganizmi dobili tudi ime. Ugotovil je, da so celice teh sevov včasih podaljšane oblike in vsebujejo metakromatska zrnca ter diaminopikolinsko kislino. Vse te lastnosti pa so značilne tudi za rodova Corynebacterium in Brevibacterium. Kinoshita je istega leta na Mednarodnem mikrobiološkem kongresu v Montrealu utemeljeval, da so celice teh bakterij lahko dalj časa v prisotnosti majhnih količin vitaminov, a manj časa, če gojišče vsebuje več teh vitaminov in povdarja, da je bolje imenovati ta organizem Corynebacterium glutaminicum. Takayana s sod. je nato dokazal, da te bakterije bližje predstavnikom rodu Corynebacterium, Brevibacterium in Arthrobacter.

12 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, MIKROBIOLOŠKE OSNOVE BIOPROCESA Od leta 1958 so znanstveniki izolirali veliko bakterij, katerih značilnost je velika proizvodnja glutaminske kisline iz dostopnih virov ogljika in anorganskega dušika. V glavnem so to bakterije rodov Micrococcus, Brevibacterium in Arthrobacter. Skupna lastnost vseh teh bakterij pa je: so gram pozitivne, ne mobilne, nesporogene, aerobne, katalaza pozitivne, elipsoidno okrogle. V naravi se redko nahajajo visokoaktivni sevi takih bakterij. Predvideva se, da so te vrste bakterij - producenti, v resnici nastali v naravi, ker so bili izpostavljeni mutagenim dejavnikom, kot so radiacija, prisotnost inhibitornih sestavin itd. Danes se predpostavlja, da je proces mutacije smer, za ustvarjanje ugodnega seva (producenta). Zaradi tega je zelo važno proučevanje pogojev gojenja in hranjenja takih sevov. Osnove za pridobivanje glutaminske kisline, so lahko dokaj enostavne. Kot izvor ogljika se na splošno rabi glukoza, ki se dobiva s kislo hidrolizo škroba, saharoza iz melase ali sladkorne pese. V novih postopkih za pridobivanje L-glutaminske kisline, se lahko uporablja različne ogljikovodike, od naravnega plina (metan, etan), parafina ali aromatičnih ogljikovodikov (benzilalkohol, pirokatehin). Kot viri dušika se uporabljajo amonijeve soli (amonijev klorid, amonijev sulfat, karbamit in amonijev nitrat), urea ali amonijak kot plin. Mnogi raziskovalci menijo, da se izkoristek glutaminske kisline lahko poveča z dodajanjem dušika postopoma. Neorganski elementi gojišča so razne soli K 2 HPO 4, KH 2 PO 4, kot izvori fosforja, ki igra zelo pomembno vlogo v celičnem metabolizmu in kot K + ion. Pomembni mikroelementi so še: Mg 2+. Zn 2+, Fe 2+, Mn 2+, ki služijo v glavnem kot aktivatorji različnih encimov. Kot stimulatorji rasti služijo ekstrakti žitaric, kvasa in biotin. Ogawa je s sod. dokazal, da večina vrst Brevibacterium proizvaja L-glutaminsko kislino in alanin. Ali prevladuje L-glutaminska kislina ali alanin pa je v veliki meri odvisna od vrste uporabljenega gojišča. V tabeli 1, so objavljeni mikroorganizmi, ki se uporabhljajo pri pridobivanju L-glutaminske. Tabela 3: Mikroorganizmi uporabljeni pri pridobivanju L-glutaminske kisline (Vučetić, 1982) VRSTA Odkritelj 1. Micrococcus glutamicus Kinoshita s sod. 2. Brevibacterium aminogenes Ota in Tanaka 3. Micrococcus glutamicus Chen, Tu in Chem 4. Bacillus megaterium-cereus Chao in Foster 5. Brevibacterium sp. Kobayashu in sod. 6. Brevibacterium flavum Okumura in sod. 7. Brevibacterium divaricatum Su in Yamada 8. Microbacterium salicinovorum Doi in Kaneko 9. Brevibacterium sp. Hashida in sod. 10. Brevibacterium thiogenitalis Kanzaki in sod. 11. Microbacterium ammoniaphilum Miyai in sod.

13 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Vse navedene kulture pretvarjajo 40% raztopino sladkorja v L-glutaminsko kislino in dajejo več kot 30 g/dm 3 glutaminske kisline. Tako je bilo, na primer, pri uporabi kulture Brevibacterium divaricatum v gojišču s 10% glukoze, možno izboljšanje pridobivanja L- glutaminske kisline, z dovajanjem močnega zračnega toka in mešanjem, nato z umerjeno inkubacijo na 303 K in ph 6,0-8,0. Naknadno dodajanje karbamida je bilo izrazito učinkovito za kontrolo ph in za vzdrževanje koncentracije amonijevega iona v gojišču. Vsekakor najzanimivejši rezultat teh raziskav pa je bil, da vse bakterije vključno z Bacillius in Arthrobacter, zahtevajo biotin in da je količina biotina ključni dejavnik pri kontroli pridobivanja L-glutaminske kisline. Veldkam in sod. so ugotovili, da obstaja izrazit odnos med pomanjkanjem biotina in sposobnosti akumulacije L-glutaminske kisline. Povdariti je treba, da auksotrofni mutant E. coli, za katero je ugotovljeno, da ne potrebuje biotina, daje znatne količine L-glutaminske kisline v gojišču BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA Več vrst bakterij rodu Brevibacterium - Corynebacterium izloča pod določenimi pogoji velike količine L-glutaminske kisline v medij, lahko tudi do 100 g/l medija. Ta ekstremna produkcija L-glutaminske kisline, pa vsekakor ni povezana le s preprostim prehodom le-te skozi membrano, ampak s kompliciranim metabolizmom proizvedene amino kisline. Vse to pa vodi do specifičnih pogojev kultivacije takih mikroorganizmov. Biokemični prekurzor glutaminske kisline je α-ketoglutarna kislina, intermediat v citratnem ciklu. Ko so znanstveniki prvič preiskovali encime citratnega cikla producerjev L-glutaminske kisline, bakterij rodu Brevibacterium - Corynebacterium, so ugotovili, da jih le-te vsebujejo vse, razen α-ketoglutarat dehidrogenaze. Nedavno pa je bilo dokazano, da je prisotna tudi α-ketoglutarat dehidrogenaza, vendar v labilni, nestalni obliki. Poleg tega je njena aktivnost v primerjavi z drugimi encimi majhna.v vsakem primeru pa je citratni ciklus takih bakterij okrnjen, prav zaradi majhne aktivnosti teh encimov. To je tudi vzrok akumulacije α-ketoglutarata. Citratni ciklus je metabolna pot odgovorna za popolno oksidacijo majhnih molekul v CO 2 v vseh organizmih. V naravi pa ne moremo pričakovati okrnjenega citratnega cikla, saj bi te bakterije bile težje kompatentne s tistimi, ki imajo popolnoma aktiven citratni ciklus. Postavlja se torej vprašanje kako so te bakterije tekom evolucije ostale v "tekmi" z ostalimi? Izkazalo se je, da producerji L-glutaminske kisline, v prisotnosti večje količine kisika lahko popolnoma oksidirajo majhne molekule po glioksilatni stranski poti, to je s pretvorbo izocitrata v glioksilat in sukcinat. Na ta način ni več akumulacije α- ketoglutarata, niti izločanja glutamata. Prav tako se nekaj L-glutaminske kisline tvori, ko je parcialni tlak kisika majhen. Ko je koncentracija kisika omejena in ni možna popolna oksidacija intermediatov, kar se pogosto tudi dogaja pri kultivaciji bakterij pri veliki gostoti, se α-ketoglutarat akumulira in nato pretvarja v L-glutamat v prisotnosti presežka amoniaka. Produkcija L-glutamata služi tem organizmom najbrž v fiziološkem namenu pri regeneraciji oksidirane oblike piridinskega nukleotida. Podoben pojav najdemo pri kvasovkah, pri tvorbi etanola.

14 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Reducirani metaboliti (etanol, glutamat; odvisno od organizma) se namreč izločajo kot stranski produkti. Na ta način lahko metabolizem takih mikroorganizmov klasificiramo kot nepopolna oksidacija. Klasičen primer nepopolne oksidacije je produkcija ocetne kisline pri bakteriji rodu Acetobacter. Za ta organizem je namreč značilno, da prizvaja acetat samo če ni dostopnega dovolj kisika.v primeru ko je na voljo dovolj kisika se namreč etanol popolno oksidira v CO 2, kot se tudi vir ogljika pri glutamatu. Čeprav nepopolna oksidacija tvori manj ATP kot popolna oksidacija, je vseeno bolj ugodna kot anairobni metabolizem, saj se pri oksidaciji piruvata v acetil-coa tvori še nekaj dodatnega ATP. Na ta način lahko vidimo, da bakterije rodu Brevibacterium - Corynebacterium tvorijo glutamat kot stranski produkt metabolizma. Da bi dosegli povečano produktivnost mutantov je bil regulacijski mehanizem biosinteze L-glutaminske kisline proučen do natankosti. Pri biosintezi L-glutaminske kisline igrata glavno vlogo naslednja dva encima: fosfoenolpiruvat karboksilaza (PEPC): katalizira karboksilacijo fosfoenolpiruvata do oksalacetata inhibira jo L-asparaginska kislina, represirata pa jo oba, tako L-asparaginska kislina kot L-glutaminska kislina α-ketoglutarat dehidrogenaza (KDH): pretvarja α-ketoglutarat v sukcinil-coa. Pri mikroorganizmih s povečano tvorbo L-glutaminske kisline, pa je nadaljna oksidacija α- ketoglutarata v sukcinat omejena, kar povzroča nastanek L-glutaminske kisline Pri mikroorganizmih s povečano produkcijo L-glutaminske kisline je K m vrednost KDH za α-ketoglutarat skoraj dva krat nižja kot vrednost za L-glutamat dehidrogenazo (GDH), ki katalizira zadnji korak do L-glutaminske kisline. Posledično je ν max za GDH do 150 krat višja kot ν max za KDH. Leta 1992 je bil tudi iz Corynebacterium glutamicum izoliran in okaraktiziran odgovoren gdh gen REGULACIJA ENCIMOV VPLETENIH V SINTEZO GLUTAMATA 1.V večini mikroorganizmov je glavna pot za sintezo glutamata GS-GOGAT pot: (1) L-Glutamat + NH 3 + ATP L-glutamin +ADP + P i (GS: glutamin sintetaza) (2) L-Glutamin + α-ketoglutarat + NADPH +H + 2 L-glutamat + NADP + (GOGAT: glutamin: oksoglutarat aminotransferaza) Sum (1) + (2): α-ketoglutarat + NH 3 + ATP + NADPH +H + L-glutamat + NADP + + ADP + P i Čeprav ta biokemijska pot porablja en ATP za vsako sintetizirano molekulo L-glutamata, je bolj zaželjena kot naslednja, spodaj opisana pot, saj ima nižjo K m vrednost (veliko nižja kot 1mM) za NH 3 in na ta način lažje izrablja amonijak.

15 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Naslednja biokemijska pot je pot glutamat dehidrogenaze: α-ketoglutarat + NH 3 + NAD(P)H +H + L-glutamat + NAD(P) + + H 2 O (GDH: glutamat dehidrogenaza) Ker je K m vrednost za NH 3 višja (ponavadi okrog 1mM), postane ta pot pomembna samo ob visoki koncentraciji NH MEHANIZEM IZLOČANJA GLUTAMATA IZ CELIC V preteklosti je bil mehanizem izločanja L-glutaminske kisline preprosto obrazložen kot fenomen "prepuščanja" ali "presežka" (Kikuchi in Nakao, 1986). Nedavno pa je Kramer (1993, 1994) podal tri mehanizme izločanja amino kislin in poroča o obstoju specifičnega prenašalnega sistema, ki je odgovoren za aktivni transport L-glutamainske kisline v Corynebacterium glutaminicum. Poleg tega pa je za dobro izločanje L-glutaminske kisline najbolj pomembno primerno gojišče. Le to naj vsebuje poleg virov ogljika še biotin ali oleat, β-laktamske antibiotike, kot je penicilin ali cefalosporin C in C 16 -C 18 nasičene maščobne kisline. Biotin, oleat ali C 16 -C 18 nasičene maščobne kisline, namreč povzročajo spremembe v sestavi maščobnih kislin v celični membrani. Posebno oleat in palmitat povzročata spremembe v premeabilnosti celične membrane za L-glutaminsko kislino (Kanzaki s sod., 1969). Ta fenomen se lahko popolnoma obrazloži z delovanjem acetil-coa karboksilaze, ki vsebuje biotin kot prostetično skupino. Encim je namreč soudeležen v biosintezi oleata in drugih maščobnih kislin, inhibirajo pa ga C 16 -C 18 nasičene maščobne kisline (Kamiryo s sod., 1976). Po dodatku penicilina pa se celična stena poveča ali podaljša. Na ta način povzroča penicilin nepopolno biosintezo celične stene, kar je posledica v izločanju L-glutaminske kisline (Shiio s sod., 1963). Na drugi strani, pa auksotrofi biotina in oleata ne morejo sintetizirati L-glutaminske kisline iz n-parafinov (Nakao s sod, 1972), saj je metabolizem glukoze in parafinov popolnoma drugačen. Poleg tega pa je izločanje L-glutaminske kisline odvisno tudi od prisotnosti glicerola; optimalna proizvodnja pa je bila dosežena ob prisotnosti manjših količin celičnih fosfolipidov. Iz tega lahko sklepamo, da je permeabilnost celične membrane za L- glutaminsko kislino kontrolirana ne samo s vsebnostjo nenasičenih maščobnih kislin, posebno oleata, ampak tudi z vsebnostjo fosfolipidov VLOGA BIOTINA V DIREKTNI FERMENTACIJI Zelo zanimiv je aspekt pri mehanizmu akumulacije L-glutaminske kisline je vloga biotina v kontroli fermentacije. Tanaka je s sod. pokazal, da se velika količina L-glutaminske kisline in manjša količina α-ketoglutarjeve in mlečne kisline, lahko pridobi, če se sev Micrococcus glutamicus razvija pri neki določeni, mejni koncentraciji biotina v gojišču. Na drugi strani se pri povečani količini biotina začno hitreje razvijati celice, kar vodi do večje potrošnje glukoze, pri čemer nastaja kot glavni produkt mlečna kislina. Optimalna količina biotina pri pridobivanju L-glutaminske kisline je 2,5 µg/dm 3. S povečanjem koncentracije biotina se poveča celična biomasa, vendar se doprinos L-glutaminske kisline hitro zmanjšuje. Podobni učinki biotina na pridobivanje L-glutaminske kisline so bili najdeni pri sevu Brevibacterium flavum. Tudi v gojiščih z biotinom in s kulturo Brevibacterium divaricatum, se ustvarja velika količina jantarne in mlečne kisline.

16 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Poudariti je treba, da optimalna koncentracija biotina za pridobivanje L-glutaminske kisline lahko varira v širokih mejah s spremembo gojišča v katerem se nahaja kultura. Tako je na primer optimalna koncentracija biotina za Brevibacterium flavum v prisotnosti glukoze kot vir ogljika 3 µg/ dm 3. Ko se za vir ogljika uporabljajo soli ocetne kisline, koncentracija biotina pade in znaša 0,3 µg/ dm 3. Količino biotina lahko zmanjšamo z dodajanjem nekaterih vitaminov: tiamin, riboflavin. Količine biotina pri Corynbacterium in Brevibacterium lahko povečujemo z dodajanjem večjih količin oleinske kisline (0,5-1 g/ dm 3 ). Okumura in sod. so ugotovili, da so destibioti, biotin-sulfoksid in biocitin enako aktivni kot biotin v primeru izboljšanja rasti L-glutaminske kisline BIOINŽINIRSKE OSNOVE BIOPROCESA Odkar je leta 1957 Kinoshita in sod. odkril Micrococcus glutamicus, je proizvodnja L- glutaminske kisline potekala v glavnem direktno iz glukoze v visoko donosnih tekočinskih fermentorjih. Na shemi 1 je podana shema pridobivanja L-glutaminske kisline. Najbolj kritična operacija je sterilizacija fermentorja in sterilizacija gojišča, da bi preprečili kontaminacijo s tujimi organizmi. Med fermentacijo je pomembna kontrola nekaterih parametrov kot so temperatura, ph, koncentracija kisika, poraba sladkorjev itd. Po h fermentacije začno produkcijski sevi akumulirati do 150 ali več g/l L-glutaminske kisline. Po deaktivaciji usedline, se biomaso loči od produkta s pomočjo centrifuge ali ultrafiltracije. Sledi koncentriranje centrifugata ali filtrata, kristalizacija, filtracija in sušenje. V novejšem času pa se vse več pozornosti posveča računalniški podpori procesa in stimulaciji primernih efektov tekom bioprocesa. To je bil princip fermentacije v tekočem gojišču. Sev Iniokulum Sladkor Kultura Sterilizacija BIOPROCES Celična separacija Biomasa Evaporacija Kristalizacija Matična tekočina Sušenje Produkt Shema 1: Shema bioprocesa prodobivanja L-glutamisnke kisline (Leuchtenberger)

17 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Uveljavlja pa se tudi kultivacija na trdnem gojišču (solid state fermentation), zato je prav, da si pogledamo primer študije (Univerza Louis Pasteur, Strasbourg) tega načina pridobivanja L-glutaminske kisline. Kot podlaga gojišču so se uporabljale 0,45-3,00 mm rezine sladkorne pese. Po dvakratni obdelavi z deionizirano vodo je sledilo sušenje pri 60 C za 30h. Sledila je 30 minutna sterilizacija v avtoklavu pri 121 C. Gojišču je bilo dodano še: glukoze, urea, KH 2 PO 4, tiamin hidroklorid, ekstrahirana koruzna tekočina, mineralnaraztopina sestavljena iz spojin: FeSO 4.7H 2 0, MnSO 4.4H 2 0, MgSO 4.7H 2 0, ZnSO 4.6H 2 0 in NaCl, (ph 7,2). REZULTATI RAZISKAVE: 1. vpliv vlažnosti: največja produkcija L-glutaminske kisline je bila pri 85-90% vlažnosti substrata po 96 h. 2. vpliv velikosti delcev: max prodkcija L-glutaminske kisline (82,22 mg/gsg) je bila, ko so substrat sestavljali delci štirih oblik zastopani v enakih količinah (0.45, 1.00, 2.00 in 3.00 mm). Med posameznimi delci pa je bila največja produkcija (43.67 mg/gsg) pri delcih narezanih na 1mm. 3. vpliv velikosti inokuluma: povečanje inokuluma iz 2.5% na 10% (v/mokro težo substrata) ne vpliva bistveno na povečano proizvodnjo. Povečanje na 20% pa povzroča hitrejšo tvorbo L-glutaminske kisline v prvih 48 urah, po 96 urah pa manj v primerjavi z ostalima dvema 4. vpliv povečane koncentracije glukoze: Znano je, da idealna koncentracija v kakršnemkoli fermentacijskem procesu vpliva na višjo produktivnost in optimalno izrabo substrata (Anderson 1968). V tej študiji je bilo uporabljeno gojišče z 1, 2, 5 in10 % glukoze, najboljše rezultate pa je dalo gojišče z 10% glukoze. 5. vpliv začetnega ph: poskus je bil izvršen pri ph 5.5, 6.5, 7.5, 8.5; največja produkcija pa je bila pri ph IMPLIKACIJA V DRUGE VEDE Kot je že bilo omenjeno, je glutaminska kislina količinsko največja proizvedena amino kislina in se uporablja kot ojačevalec okusa pri mesu, perutnini, morskih sadežih, juhah, enolončnicah itd. Vendar pa ima vlogo ojačevalca samo L oblika glutaminske kisline, D oblika te vloge nima. Največ pa se uporablja mono natrijeva sol glutaminske kisline (monosodium glutamat MSG), ki daje svojstven "umami" okus. PORABA IN METABOLIZEM Na-glutamata: V Veliki Britaniji je trenutna poraba na osebo 4g Na-glutamata na teden. Tudi podatki za ZDA se približno sovpadajo s tem in znašajo 0,55 g na osebo na dan. Na Tajvanu pa je poraba na prebivalca veliko večja in znaša povprečno 3 g Na-glutamata na dan. Čeprav je metabolizem dodanega Na-glutamata v človeškem telesu popolnoma enak naravno sintetiziranemu, se pojavljajo razna gibanja, ki nasprotujejo uporabi dodanega Naglutamata. Na drugi strani pa se pojavljajo težnje v prid Na-glutamatu. Tako naj bi prav ta znižal porabo natrija dobljenega iz kuhijske soli za 30 do 40%. FDA (Food and Drug Administration) je že leta 1958 priznala mono Na-glutamat kot "GRAS(Generally Recognized As Safe)" sestavino začimb.

18 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Od takrat naprej je bilo narejenih še ogromno dodatnih biokemičnih, toksikoloških in medicinskih študij, ki so potrdile mono Na-glutamat kot varen proizvod za splošno populacijo, vključujoč nosečnice in otroke. Poleg tega pa se glutaminsko kislino lahko uporablja tudi kot vlažilec v kozmetiki, želatinski agent v rastlinskem olju in za oljne disperzije.

19 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, PROIZVODNJA AMINO KISLIN, KI SE PRETEŽNO UPORABLJAJO V PROIZVODNJI ŽIVALSKE KRME 6.1. PROIZVODNJA LIZINA BIOKEMIJSKE OSNOVE BIOPROCESA Lizin oziroma α,ε-diaminokapronska kislina pripada esencialnim aminokislinam. Kemijsko je lizin diaminomonokarbonska kislina. Molekulska masa lizina je 146,19 g/mol, kristali so bele barve in imajo igličasto obliko heksagonalnih ploščic. Je dobro topen v vodi, kislinah in bazah. Težkotopen je v alkoholu, popolnoma netopen pa v etru. S klorovodikovo kislino lizin tvori monoklorhidrat lizina. V tej obliki se nahaja tudi večina komercialnih preparatov lizina. S klorovodikovo kislino pa lahko lizin tvori poleg monoklorhidrata tudi diklorhidrat. Lizin tako kot druge aminokisline reagira z nihidrinom. Pri segrevanju surovega lizina ali pri tretiranju vodnih rastopin lizina z encimom lizin dekarboksilaza se sprošča iz lizina CO 2, pri čemer nastaja kadaverin, ki ima toksične lastnosti. Lizin je specifična aminokislina, ki ima različne poti biosinteze pri različnih organizmih. Pri kvasovkah, glivah, aktinomicetah in nekaterih algah se prične tvorba lizina z α- aminoadipinske kisline (α-aak). Pri bakterijah se prične tvorba lizina pri asparaginski kislini in se nato vrši preko 2,6-diaminopimelinske kisline (DAP). Prava posebnost so rastline, kjer so našli kar obe poti, vendar pri večini rastlin prevladuje pot biosinteze preko DAP.

20 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Shema 2: Shema biosintetskih poti lizina (Vučetić, 1982)

21 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, MIKROBIOLOŠKE IN BIOINŽENIRSKE OSNOVE BIOPROCESA DVOSTOPENJSKO PRIDOBIVANJE LIZINA Motoda pridobivanja lizina z uporabo»prekurzorjev«je dvostopenjska metoda. Proces se vodi v dveh delih. Najprej gojimo mikroorganizem, da dobimo odgovarjajočo biomasno kulturo, iz katere pripravimo encimski preparat, nakar se vrši biološka transformacija gotovega»prekurzorja«v lizin. Kot encimski preparati se uporabljajo cele oziroma razgrajene biokulture: E. Coli, Arthrobacter, S. cerevisiae, M. glutamicus, itd.. kot»prekurzorji«pa se uporabljajo L in DL-aminokisline, DL-5-(aminobutil), hidantoin, 5-formil-2-oksivalerijska kislina, itd.. Fermentacija lizina s homoserinskim mutantom M. glutamicus-95 je tipičen dvofazni sistem. V prvi fazi narašča biomasa. Biokultora je v tej fazi sestavljena iz velikega števila bazofilnih celic. V drugi fazi pa se zmanjša rast celic, prične pa se sinteza lizina v fermentacisjki brozgi. Celice so v tej fazi male in slabo bazofilne. Dvofazni sistem fermentacisjkega postopka velja tudi za rod Brevibacterium sp. 22. Sama kinetika fermentacijskega postopka se pri the dveh producentih razlikuje v hitrosti rasti biomase in hitrosti sinteze lizina, prav tako pa se razlikujeta po potrošnji sladkorja in mineralnega dušika. ENOSTOPENJSKO PRIDOBIVANJE LIZINA Pri enostopenjskem načinu se L-lizin pridobiva direktno s fermentacijo iz skladokorja ali ogljikovodikov oziroma njihovih oksidacijskih oblik (acetat, etanol) in mineralnega dušika (amonijeve soli in karbamid). Kot proizvajalci se uporabljajo mutanti iz niza glutamat sintetičnih mikroorganizmov. Od vseh auksotrofnih mutantov večjo količino lizina sintetizirajo mutanti, ki so deficitni pri treoninu, izolevcinu, prolinu, tirozinu in fenilalaninu. Kot najboljši producenti so se pokazali homoserinski mutanti Micrococcus glutamicus-702 (ATCC ) in 901 (ATCC ). Prav ti se lahko uporabljajo za industrijsko pridobivanje te aminokisline, saj saj je njihov doprinos tudi do 20g/dm 3. Lizin pa sintetizirajo tudi homoserisnki mutanti Brevibacterium amononiages, Aerobacter aerogenes, Corynebacterium sp., Azotobacter suiz, Brevibacterium flavum, kakor tudi homoserinski mutanti, ki koristijo ogljikovodike in njihove oksidacijske proizvode; to so Brevibacterium acetoacetidophilum, B. ketoglutamicum, Arthrobacter parafineus in drugi. Vsi našteti mutanti imajo spremenjeno sintezo homoserin dehidrogenaze PRIPRAVLJALNI POSTOPKI Aminokislinski metabolizem večine lizinskih producentov je precej labilen. Maksimalni izkopiček je pogojen s sestavo gojišča, temperaturo, prezračevanjem in ph. Večina lizinskih producentov potrebuje za svojo rast biotin in homoserin, ki ga lahko zamenja treonin oziroma metionin. Ta dva dejavnika sta ključnega pomena pri sestavi gojišča in imata dvojno vlogo pri samem metabolizmu. Regulirata rast biomase in vplivata na izkoristljivost različnih metabolnih poti.

22 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, Če je koncentracija treonina manjša od optimalne se zmanjša rast biomase, sorazmerno temu pa se zmanjša tudi količina produkta (lizina). Pri večjih koncentracijah od optimalne pa se rast biomase povečuje, medtem ko količina produkta pada. Koncentracija biotina vpliva na vse glutamat sintetične bakterije. Povečevanje koncentracije biotina preko optimalne ne vodi do povečanja produkta, ampak do sinteze glutamisnke kisline IZVOR OGLJIKA Kot vir ogljika pri sintezi lizina se uporabljajo saharoza, glukoza, fruktoza, manoza in maltoza, vendar je naučinkovitejši vir ogljika saharaoza (2 x več sintetiziranega lizina kakor pri uporabi glukoze). S povečevanjem koncentracije sladkorja se povečuje tudi koncentracija lizina, vendar se s tem zmanjša učinkovita uporaba sladkorja, prav tako pa se podaljša čas fermentacije. Optimalna koncentracija sladkorja znaša 10-14%. Pri industrijskem pridobivanju lizina se kot izvor ogljika uporablja melasa. Skupaj z melaso (15-20 %) se v gojišče dodaja tudi potrebna količina biotina in treonina. Ker pa melasa ni standardizirana surovina, tudi izplen lizina zelo variira. Kot perspektivna surovina za pridobivanje lizina so se pokazali tudi normalni ogljikovodiki, tako plinski, tekoči kot tudi trdni in derivati etilena (ocetna kislina, etanol). Lizinski producenti, ki uporabljajo oglikovodike kot izvor ogljika, so homoserinski ali treoninski mutanti specialnih mikroorganizmov: Brevibacterium ketoglutamicus, Arthrobacter parafineus, Corynebacterium hydrocarboclatus POTREBNE SOLI Dober izvor mineralnega dušika za biomaso je amonijev klorid in amonijev sulfat. Mutanti M. glutamicus boljše uspevajo ob prisotnosti amonijevega klorida, mutanti B. flavum in Corynebacterium sp H-454 boljše uspevajo ob prisotnosti amonijevega sulfata. Pri fermentaciji lizina je zelo ugodna pot vnašanja dušika v obliki amonijevega acetata, najslabše pa bakterije koristijo dušik v obliki nitrata. Za pridobivanje velikih koncentracij lizina, ima poleg koncentracije in oblike vnosa dušika, pomembno vlogo tudi razmerje dušik proti ogljik. Za M. glutamicus je to razmerje 1:1. Vsaka porušitev tega razmerja v korist dušika vodi do povečane sinteze alanina. Neobhodne sestavine gojišča so soli fosforja in magnezija, kakor tudi mikroelementov (Mn 2+, Fe 2+, Cu 2+ ). Fosfor se dodaja v obliki čistih soli K 2 HPO 4 ali skupaj z melaso in koruznim ekstraktom, pri uporabi kombiniranih gojišč. V gojiščui je Mg 2+ neobhodna sestavina, saj je njegova prisotnost povezana s sodelovanjem v encimskih procesih inaktivacija β-aspartat kinaze AERACIJA Prezračevanje in mešanje med samo fermentacijo odločilno vplivata na končno količino proizvedenega lizina. Različne kulture potrebujejo različno prezračevanje. Tako se pri Brevibacterium sp. 22 z intenzivno aeracijo povečuje količina lizina, hkrati pa se tudi zmanjša čas fermentacije. Pri nezadostni aeraciji pa se piruvična kislina potroši za gradnjo mlečne kisline in alanina.

23 Proizvodnja aminokislin, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilske tehnologije, ph in TEMPERATURA Za rast številnih proizvodnih kultur lizina je optimalna temperatura med 28 in 30 C in optimalni ph od 5,0 do 9,0. Povečanje temperature pri M glutamicus-95 do 37 C onemogoča rast in izzove avtolizo celic. Optimalni ph skozi celoten proces fermentacije lizina je 7,2±0,2 za M. glutamicus in 7,0-7,6 za Brevibacterium sp KONČNI POSTOPKI Za pridobivanje kristalnega lizina se celična masa odcentrifugira, preostala fermentacijska brozga pa se spusti skozi ionski izmenjevalec. Lizin se eluira z 2,0 3,5% raztopino NH 4 OH, nakar se eluat upari v vakumu pri temperaturi 333 K do 1/20 1/30 začetne prostornine. S pomočjo HCl dobimo ph 4,5-5,0 in počakamo da temperatura pade na C. V raztopini tako kristalizira lizin. S precejanjem ali centrifugiranjem se pridobiva tehnični lizin, ki vsebuje % lizinmonoklorhidrata. Za pridobivanje čistega lizina se kristali tehničnega lizina segrevajo do 70 C v majhni količini vode ob dodatku aktivnega oglja in konstantnem mešanju. S HCl znižamo ph na 4,9 in tako raztopino uparimo. Iz uparjene raztopine kristalizira lizin. Kot dodatek živalski krmi pa se lahko uporablja koncentrat lizina. Po fermentaciji se fermentacijska brozga nakisa do ph 5,0 6,0. Za stabilizacijo se doda 0,15% raztopina natrijevega bisulfata in se nato taka brozga upareva v vakumskem uparjalniku od 40 50% suhe snovi.