ELEKTROKEMIJA PROTEINOV

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo ELEKTROKEMIJA PROTEINOV Podiplomski študij Predmet: Elektrokemijske analizne metode Predavatelj: prof.dr.boris Pihlar Ljubljana, december 2001

2 KAZALO 1. Uvod Voltametrija proteinov monoplastjo molekul 3.2. Protein film voltametrija Modifikacija proteinov Modifikacija elektrode Encimsko katalizirana reakcija na elektrodi Biosenzorji Literatura 19 2

3 1. UVOD "## $%& ' ' ' ' ' ' )#& *#& ' voltametrija. "+,$+-.$/.01/2+3. ki ga analitik uporablja pri razvoju metod. Ni posebej primerna tehnika za kvantitativne ' sistem ## ' & 6" & podatke: višini katodnega in anodnega vrha I pc, I pa ) ter potenciala katodnega in anodnega vrha E pc, E pa ). 3

4 Napetost - Slika 1: Spreminjanje napetosti v je neka snov elektroaktivna. Tokovni odziv v odvisnosti od potenciala je dokaz, da je bil - - da je reakcija reverzibilna je razmerje katodnega in anodnega toka enako 1 pri vseh hitrostih snemanja spektra. Razlika v napetosti med enim in drugim vrhom E) je enak 59,2 mv/n,, linearno s kvadratnim korenom hitrosti preleta. Ta lastnost velja le pri difuzijsko kontrolirani ' proces: a) difuzijsko kontroliran proces; b) prisiljena redoks snov. 4

5 sloj ali tako, da redoks snov imobiliziramo na površino elektrode. Zadnji primer je še posebej pomemben pri elektrokemiji proteinov. 68 reakcija kontrolirana z linearno difuzijo. Drugi primer prikazuje voltamogram pri katerem so ' 1 1/2 se ujema z kvadratnim korenom rotacijske hitrosti. Tretji primer pa prikazuje voltamogram pri katerem je redoks snov imobilizirana na površino elektrode. Oksidacijski in redukcijski vrh imata enako višino in se nahajata pri enakem potencialu, ki ustreza formalnemu potencialu adsorbiranega redoks para. Višina vrha je direktno proporcionalna hitrosti snemanja. ' meritev. Lahko opazujemo reakcijske produkte, ki se tvorijo na površini, in ki so lahko tudi 6 ' reverzibilnost redoks para, število prenešenih elektronov pri oksidaciji ali redukciji, konstanto hitrosti, konstanto formacije, reakcijske mehanizme in difuzijske koeficiente. 2 selektivno spreminjamo hitrost spreminjanja potenciala, temperaturo, koncentracijo snovi ali grafu, ki prikazuje odvisnost I pc proti kvadratnemu korenu hitrosti preleta mora biti odvisnost premosorazmeren difuzijskemu koeficientu, kot to lahko vidimo iz Randles-Sevcik-ove i pc = A D v 269 n C b i pc = višina vrha A) n = število elektronov A = površina cm 2 ) D = difuzijski koeficient cm 2 s -1 ) v = hitrost preleta Vs -1 ) C b = koncentracija v raztopini mol) $ 6: prikazuje graf odvisnosti produkta potencialne razlike vrhov in števila prenešenih elektronov, od 1/ kvadratnim korenom hitrosti preleta). Iz grafa lahko vidimo, da pri velikih hitrostih 5

6 ' ' reakcij ali zaradi hitrosti prenosa naboja. n Ep),mV Slika 4: Graf odvisnost I pc proti kvadratnemu korenu hitrosti preleta 1/v 1/2 Slika 5: Graf odvisnost produkta potencialne razlike vrhov in števila prenešenih elektronov, od 1/kvadratnim korenom hitrosti preleta). oksidacijsko redukcijskih procesov predvsem v organskih in organokovinskih sistemih, 6 lahko ugotavljamo tudi prisotnost intermediatov. 3. VOLTAMETRIJA PROTEINOV ' pogojih. Glavni faktor, ki zavira direktni prenos elektrona med elektrodo in proteinom je + ; 0 4 voltametrija-pfv). 6

7 Direktna elektrokemija proteinov je bila razvita v poznih 70-tih letih. Najbolj enostavna. Noben od teh pristopov ne zagotavlja stabilnih proteinskih plasti na elektrodi. oziroma tvorbo stabilnega proteinskega filma PFV) DIFUZIJSKA VOLTAMETRIJA PROTEINOV NA ELEKTRODAH 21$1-1+<16/.=+$0$.6/30$1,>$. difuzijsko kontrolirano elektrokemijo citokroma c. Organski adsorbati zagotavljajo 6? proteinov. Interakcije med adsorbiranimi molekulami so pomembne in vodijo do plasti kjer A& in molekulo proteina. Selektivnost tako modificirane elektrode lahko spreminjamo s funkcionalno skupino y. " - 9 9B&A66A 449&55. ' 4 7

8 proteinom in elektrodno površino). Pomemben efekt je tudi blokiranje reakcijskih mest za proteine, kar so študirali z mešanjem organskih aktivnih adsorbatov in neaktivnih soadsorbatov, ki ovirajo Y skupino adsorbiranih molekul. C + 2 O 3 in 4,4`-PySSPy modificiranih elektrod dobili lepe stabilne voltamograme, medtem, ko so pri komercialnih vzorcih, ki 9 9B&A66A In 2 O 3 modificirane elektrode tako, da je elektrodna reakcija proteina blokirana PROTEIN FILM VOLTAMETRIJA Protein film voltametrija PFV) se razlikuje od tradicionalne voltametrije proteinov v tem, da opazuje film proteinskih molekul direktno adsorbiranih na površino elektrode. Ne voltametriji in zato ni odvisnosti od masnega transporta oziroma difuzije v raztopini. kovinske elektrode na katere pritegnejo proteine preko adsorbiranih organskih redoks ' 1 nemodificiranih grafitnih elektrod, ki nimajo dobro definirane površine na katere se mnogi ' 8"7 7## D ' študiju dinamike sistema. Lahko skeniramo zelo hitro brez vpliva masnega transporta proti in stran od elektrode. 8

9 δ 1/n i peak n 2 #$%&' Slika 8: Osnovni tipi signalov pri PFV. Slika 8 prikazuje tri osnovne tipe signalov, ki jih lahko opazimo v PFV. Na sredini je C 6 ' 1 [3Fe-4S] klastrov v ferodoksinih. Slika 9 prikazuje procese oksidacije, redukcije, protonacije in deprotonacije pri [3Fe-4S] 6 7# [3Fe-4S] klastrov posnete pri treh ' 9

10 ' ' samo med Slika 9: Procesi oksidacije, redukcije, protonacije in deprotonacije pri [3Fe-4S] klastrih. )[3Fe-4S]$$$$ 8"7.-++/2=12/1+6,1%.E+$0..2;++1$1,/21, ' imobilizacija proteina na površino kovine ima precej slabosti denaturacija, nestabilnost in 5, gostote nanosa. Proteinski film lahko tvorimo tako, da modificiramo elektrodo, protein ali pa 10

11 6 77 elektrodi. Primer a predstavlja tvorbo plasti z modifikacijo proteina, primera b in c tvorbo plasti z modifikacijo proteina in elektrode, medtem ko primeri d,e in f predstavljajo tvorbo plasti z modifikacijo elektrode. a) Metaloprotein vezan na Au elektrodo preko posebej obdelane cisteinske skupine. b) Protein modificiran s histidinom povezan z Au elektrodo modificirano s kovinskim ionom. c) Na cistein modificirano elektrodo vezan zvitek štirih elektronov proti modificiranemu encimu ali elektrodi. d) Protein adsorbiran na plast organskih redoks molekul na Au elektrodi. Na sliki je prikazana elektrokatalitska interakcija s topnim kofaktorjem v raztopini. e) Protein vezan v membrani podobno lipidno dvoplast na elektrodi. Plastovit pristop. Au elektrodna površina je modificirana z negativno nabitim alkantiolom. Polimera predstavljata vezna elementa med naprimer peroksidazo in oksidazo. * MODIFIKACIJA PROTEINOV, na razpolago kemijske modifikacije proteinov. En tak primer je vezava polietilen oksida na ' Zelo dober primer modifikacije proteina je pristop Lego. Uporablja proteine z znanimi elektrokemijskimi lastnostmi kot posrednike pri elektronskem prenosu. Tako tvorijo umetno redoks verigo, ki je sposobna komunicirati z elektrodo. Vezniki med obema molekulama je lahko nek peptid povezan med C skupino prvega in N skupino drugega) ali disulfidni most ali kombinacija obeh. 11

12 Slika 15: Lego pristop za modifikacijo proteina za pripravo tankega proteinskega filma na površini elektrode. Znana sta dva primera pri katerih modificiramo protein in elektrodo. V prvem primeru je protein modificiran s histidinskim delom, ki je sposoben povezati protein z elektrodo modificirano z nitrilotriocetno skupino kompleksirano s Cu 2+ ioni. V drugem primeru je '. dveh cisteinskih ostankov na dveh od štirih spiral. Elektrodo modificiramo s cistaminom in ' / modificiranemu encimu MODIFIKACIJA ELEKTRODE Vezava prevodnih polimerov povezanih v membrani podobne strukture ali pa nastanek plasti iz organskih molekul, lahko pripelje do visoke ponovljivosti in stabilnosti struktur. Znani so 12

13 Monoplast organskih redoks molekul / molekulami modificirane elektrode npr. alkantiolat/au elektroda. Slika 12 predstavlja shemo takega sistema pri katerem je monoplast pripravljena z uporabo karboksil alkantiola, ki zagotavlja kislo površino s katero lahko reagira reaktivno mesto citokroma c. Slika 13 prikazuje c. elektronskega prenosa. Stabilni hidrofilni elektrodni materiali kot so kovinski oksidi, spoliran ogljik itd., ki imajo kislo C-O skupino so prav tako sposobni za elektrostatsko kontrolirano adsorbcijo proteinov, brez izgube njegove biokemijske aktivnosti. Za bolj kisle proteine lahko izboljšamo 6 elektrodne površine še ni znana. Dokazali so, da so proteini vezani na tako modificirane Slika 12: Shematski prikaz adsorpcije citokroma c na alkantiol modificirano elektrodo. Cilindri " **+ " skupine povezane z Au elektrodo. Polipeptidna veriga molekul citokroma c prikazuje elektrostatsko favorizirano orientacijo. 13

14 citokroma c na modificiranih Au $ modifikacijo elektrode je bila uporabljena HSCH 2 ) 10 COOH., elektrode je bila uporabljena HSCH 2 ) 5 COOH. Površinsko aktivne snovi / uporabljamo tudi za imobilizacijo proteina na elektrodni površini. 0 površinsko aktivna snov-protein lahko naredimo tako, da razpršimo raztopino surfaktanta DDAB-dodecildimetilamonijev bromid) v kloroformu in pustimo, da topilo odpari. Tako 0 6 vodno dispergirano površinsko aktivno snov. Mešanico nato zlijemo na elektrodo in pustimo, 6 79 E 6.. E.= ' nekaterimi drugimi površinsko aktivnimi snovmi, pa se vsebnost proteina zmanjša potem, ko ' 8# debeline okoli 1µ ' *:&F# G signala po enem mesecu hranjenja v pufru. Netopni surfaktantni filmi so danes nek splošen in je podobna tisti v bioloških membranah. Ti filmi se elektrokemijsko obnašajo kot tanke plasti znotraj katerih lahko proteini prosto difundirajo, vendar ta visoka mobilnost proteinov v tem ' 14

15 aktivne snovi na površino elektrode. Slika 14: Postopek priprave proteinskega filma z uporabo lipidnih dvojnih plasti. Pristop»layer by layer«' med razdaljo aktivnih plasti. Tehnika»layer by layer«ponuja dobro kontrolo nad zgradbo filma in debelino. Pri tem se uporablja osmijev redoks polimer, peroksidaza in encim, ki proizvaja vodikov peroksid npr. glukozna oksidaza ali alkohol oksidaza. V obeh primerih se uporablja 3-merkapto-1-propan sulfonska kislina za modifikacijo Au elektrodne površine, da zagotovi negativni naboj na površini, ki je potreben za adsorpcijo redoks polimera. Zaporedna ' 15

16 Ti filmi zagotavljajo imobilizacijo proteina znotraj filma in zato dobimo elektrokemijski ' 6 aktivna mesta v fotosintetskih reakcijskih mestih ENCIMSKO KATALIZIRANA REAKCIJA Eden protein od redoks para bo tako v vlogi substrata drug pa v vlogi kofaktorja ali kosubstrata. Aktivni center se nahaja globoko v notranjosti proteina zato je prenos elektrona zelo šibek. Ker oksidoreduktaze selektivno katalizirajo reakcije, ki so analitsko pomembne, ' ', obnovijo svoje redoks stanje na elektrodi. Hitrost obnove redoks stanja naj bi bila proporcionalna hitrosti encimatske reakcije in nenazadnje koncentraciji substrata. Taka ' Imamo dve glavni vrsti oksidoreduktaz: oksidaze, ki uporabljajo kisik kot kosubstrat in..- ' elektroda uporabna kot senzor je potrebno, da ne uporablja nobenega drugega reagenta, ki bi ga bilo potrebno dodat v raztopino. Veliko encimov uporablja NAD ali NADH kot kofaktor in zato je zelo pomembna imobilizacija encima dehidrogenaza) in ponovna obnova.d.< 67?,.< H, 8 9 dihidroksibenzaldehid ali glutaraldehid kot je to prikazano na sliki. Te skupine so nato povezane z polimerom, ti pa z elektrodno površino. NAD je najprej imobiliziran z PQQ 4 5 ', mestu je povezan z glutaraldehidom, ki stabilizira plast. 16

17 Slika 16: Shema laktatdehidrogenazne encimske elektrode BIOSENZORJI Omenjeni procesi so zelo pomembni za izdelavo nanonaprav kot so gorivne celice, umetni fotosintetski sistemi, biosenzorji Medicina si danes vse bolj prizadeva narediti sisteme, ' ', ' ' 0 lahko pogosto uporablja. Elektrokemijski senzorji predstavljajo pomemben del pri enostavnosti in uporabnosti. Najpomembnejši elektrokemijski biosenzor je senzor za merjenje glukoze v krvi. Pri prvem takem hitrem testu glukozna oksidaza oksidira glukozo v prisotnosti kisika. Peroksid, ki nastane iz kisika se nato oksidira na delovni elektrodi elektrokemijske.& 17

18 prikazan na sliki 17. Zaporedje reakcij znotraj omenjenega senzorja so prikazane na sliki 18. > glukozo reagira glukozna oksidaza ali dehidrogenaza. Prenos elektrona izkoristi ferocen ali ferocianid, ki deluje kot posrednik prenosa elektrona med elektrodo in merjeno snovjo. Slika 17: Accu-Chek senzor. Slika 18: Zaporedje reakcij znotraj Accu-Check senzorja. 9.,$3>-1, Zadnjih 10 let se je pokazal velik napredek v elektrokemiji proteinov, ki je še posebej usmerjen v razumevanje kemije mejne plasti med elektrodo in molekulami, ki reagirajo z njo. $ ' biokemijske gorivne celice. Tudi razvoj bioelektronskih miniaturnih naprav se bo še bolj 18

19 ' 6 znanstvenikov. 5. LITERATURA 1. F.A.Armstrong, G.S.Wilson, Recent developments in faradaic bioelectrochemistry, Electrochimica Acta 45, , G.Gilardi, A Fantuzzi, S.J.Sadeghi, Engineering and design in the bioelectrochemistry of metalloproteins, Current Opinion in structural Biology, 11, , D.A.Skoog, F.J.Holler, T.A.Nieman, Principles of Instrumental Analysis, 5 th Ed, Sounders college publishing, 1998, D.D.Schlereth, Characterization of protein monolayers by surfac plasmon resonance combined with cyclic voltammetry in situ, J. of Electroanal. Chem., 464, , I. Taniguchi, Probing Metalloproteins and Bioelectrochemical Systems, The Electrochemical Society Interface, Vol.6, No.4, 34-37, K.Chen, J.Hirst, R.Camba, C.A.Bonagura, C.D.Stout, B.K.Burgess, F.A.Armstrong, Atomically defined mechanism for proton transfer to a buried redox centre in a protein, Letters to Nature, 405, , H.A.O.Hill, The development of bioelectrochemistry, Coordination Chemistry Reviews, 151, , E.F.Bowden, Wiring Mother Nature, The Electrochemical Society Interface, Vol.6, No.4, 40-45, L.S.Kuhn, Biosensors: Blockbuster or Bomb?, The Electrochemical Society Interface, Vol.7, No.4, 26-31, J.F.Rusling, Electrochemical Enzyme Catalysis, The Electrochemical Society Interface, Vol.6, No.4, 26-31,