XÁC ĐỊNH ĐOẠN MÃ VẠCH ADN CHO TRÀ HOA VÀNG TAM ĐẢO (Camellia tamdaoensis): LOÀI CÂY ĐẶC HỮU CỦA VIỆT NAM

Transcription

1 Tạp chí Nông nghiệp và PTNT (2015), 5: XÁC ĐỊNH ĐOẠN MÃ VẠCH ADN CHO TRÀ HOA VÀNG TAM ĐẢO (Camellia tamdaoensis): LOÀI CÂY ĐẶC HỮU CỦA VIỆT NAM TÓM TẮT Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Phong Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Trường Đại học Lâm nghiệp Trên cơ sở các thông tin của gen matk thuộc loài Trà vàng pêtêlô đã công bố (Mã số KJ ), một cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để dựa trên khuôn ADN tổng số của 5 mẫu cây Trà hoa vàng Tam Đảo (TĐ1,TĐ2, TĐ3, TĐ4 và TĐ5) và 5 mẫu Trà vàng lá dày (LD1, LD2, LD3, LD4 và LD5). Kết quả PCR đã chỉ ra, tất cả các băng ADN đã được nhân lên từ các mẫu thí nghiệm có cùng một kính thước khoảng 950bp, tương tự với kính thước lý thuyết của đoạn gen matk ở loài Trà vàng pêtêlô. So sánh trình tự nucleotide của các mẫu sản phẩm PCR cho thấy không có sự khác biệt ở các lần lặp lại và các mẫu trong cùng một loài. Kết quả so sánh cho thấy trình tự nucleotide của đoạn gen matk ở cây Trà hoa vàng tam đảo so với ở cây Trà vàng lá dày chỉ sai khác 1 nucleotide (thay A bằng G) ở vị trí 508, so với ở loài Trà vàng petêlô thì có 1 nucleotide sai khác (thay C bằng A) ở vị trí 613; so sánh trình tự nucleotide của gen matk ở Trà vàng lá dày so với trà vàng petêlô thì có 2 nucleotide sai khác là thay G bằng A ở vị trí 508 và thay C bằng A ở vị trí 613. Trình nucleotide của đoạn gen matk xác định được từ cây Trà hoa vàng tam đảo và Trà vàng lá dày đã được đăng kí trên ngân hàng gen quốc tế (NCBI) với mã số KP và KP Trình tự này có thể là một trong các chỉ thị dùng để phân loại các loài trà hoa vàng của Việt Nam. Từ khóa: gen matk, giám định loài, mã vạch ADN, trà hoa vàng, tam đảo ĐẶT VẤN ĐỀ Trà hoa vàng là chi thực vật rất đa dạng về loài, theo thống kê trên thế giới có khoảng 300 loài và hàng chục biến chủng khác nhau. Từ những năm 60 của thế kỷ 20, lần đầu tiên trà hoa vàng đã được phát hiện ở Quảng Tây, Trung Quốc và từ đó Trà hoa vàng được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm vì nó có một số công dụng đặc biệt. Phần lớn các loài trà hoa vàng phân bố ở Quảng Tây, Vân Nam của Trung Quốc và Việt Nam (Ninh et al, 2007). Các nhà thực vật xem các loài trà hoa vàng là nguồn gen quý hiếm cần được bảo vệ nghiêm ngặt. Năm 1965 các nhà thực vật học người Trung Quốc đã mô tả loài trà hoa vàng có ở Trung Quốc và đặt tên khoa học là Camellia chrysanda và loài này được xếp trong 10 loài thực vật quý và hiếm nhất của Trung Quốc. Đến nay, ở Trung Quốc đã có 28 loài trà hoa vàng được ghi nhận. Ở Việt Nam, qua hơn 10 năm điều tra và nghiên cứu đã phát hiện được 24 loài trà hoa vàng. Trong đó, có 8 loài ở Vườn Quốc Gia Tam Đảo, đây là nguồn vô cùng quý hiếm cho hệ thực vật ở Việt Nam nói chung và Tam Đảo nói riêng (Hakoda et al, 1998; Ninh et al. 2007). Trà hoa vàng tam đảo (Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh), do hai nhà khoa học Trần Ninh và Hakoda Naotoshi người nhật bản phát hiện và công bố trên tạp chí khoa học của Đại học Quốc gia Hà Nội và tạp chí trà Quốc tế vào năm Đây là loài Trà đặc hữu ở Vườn Quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc, Việt Nam (Ninh et al, 2007; Hakoda et al, 2007). Loài Trà hoa vàng tam đảo có giá trị kinh tế, dược liệu và thẩm mỹ rất cao, số lượng cá thể còn lại rất ít và khu phân bố hẹp (Ninh và Hakoda, 2010). Đến nay, các nghiên cứu về đặc điểm sinh học, sinh thái và gây trồng loài Trà hoa vàng còn rất hạn chế, chưa toàn diện và đồng bộ. Công tác bảo tồn các loài trà quý này cũng chưa được chú ý, đặc biệt là các nghiên cứu về phát triển và ứng dụng loài trà này hầu như còn bỏ ngỏ (Ninh và Hakoda, 2010). Đến nay, các nghiên cứu về phân loại Trà hoa vàng ở Việt Nam chủ yếu dựa vào chỉ thị hình thái. Phương pháp này trong nhiều trường hợp còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế, đặc biệt một số loài tra hoa vàng có nhiều đặc điểm hình thái khá giống nhau nên khó khăn cho việc phân loại. Trên thế giới, ngoài việc sử dụng các chỉ thị hình thái cũng đã sử dụng các chỉ thị phân tử như gen matk, ITS, rbcl để phân loại, giám định một số loài trà, như: Camellia sinensis, Camellia petelotii, Camellia yunnanensis, Camellia oleifera, Camellia taliensis, Camellia japonica, Camellia cuspidata, Camellia grandibracteata, Camellia albogigas,.. Như vậy, việc kết hợp giữa chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử ADN sẽ làm tăng độ chính xác và nhanh chóng xác định được sự khác biệt giữ các sinh vật. Đến nay các nhà khoa học đã xác định được nhiều đoạn ADN đặc hiệu được sử dụng làm mã vạch ADN. Mỗi đoạn mã vạch DNA có những đặc trưng riêng và có khả năng phân biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau. Việc lựa chọn những đoạn ADN (gen) đặc trưng để làm mã vạch ADN là phụ thuộc vào từng nhóm sinh vật cụ thể và mục đích nghiên cứu (Kress et al, 2008). Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra, ở rất nhiều loài thực vật sử dụng gen matk lục lạp có thể phân biệt được loài thập chí dưới loài (Chase et al, 2005; Yakawa et al, 2006; Storchova et al, 2007; Ford et al, 2009). Gen matk mã hóa cho enzyme maturase, enzyme này có liên quan đến quá trình loại bỏ các intron trong quá trình phiên mã mrna. Do gen matk tiến hóa nhanh và có mặt ở hầu hết các loài thực vật nên được sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu phát sinh loài, mối quan hệ di truyền ở thực vật. CBOL (Consortium for the Barcode of Life) đã tiến hành phân tích gen matk ở trên 550 loài thực vật và thấy rằng có hơn 90% mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại gen matk bằng 1 cặp mồi, CBOL đã đề nghị sử dụng gen matk là một trong những chỉ thị chuẩn cho việc phân loại thực vật. Do Trà hoa vàng tam đảo là loài mới được phát hiện, chưa có nghiên cứu nào về phân tích gen của loài trà này được công bố. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn đoạn gen matk để nghiên cứu, kết quả nghiên 123

2 cứu này sẽ phục vụ cho các nghiên cứu khác về đa dạng di truyền, phân loại và giám định loài góp phần nâng cao hiệu quả bảo tồn và phát triển loài Trà hoa vàng quý hiếm, đặc hữu của Việt Nam. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng, vật liệu: Đối tượng nghiên cứu: loài Trà hoa vàng tam đảo (Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh) và loài Trà vàng lá dày (Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda) mọc tự nhiên ở Vườn Quốc gia Tam đảo, Vĩnh Phúc. Vật liệu nghiên cứu: Các mẫu lá bánh tẻ của cây Trà hoa vàng, mỗi loài lấy 5 mẫu lá ở 5 cây khác nhau. Sau khi thu, mẫu được cho vào túi nilon, buộc kín rồi đưa về phòng thí nghiệm bảo quản ở -80 o C để tách chiết ADN phục vụ nghiên cứu. Kí hiệu các mẫu Trà hoa vàng tam đảo: TĐ1, TĐ2, TĐ3, TĐ4, TĐ5; Trà vàng lá dày: LD1, LD2, LD3, LD4, LD5; TĐ1 TĐ2 TĐ3 TĐ4 TĐ5 Hình 01. Các mẫu lá Trà hoa vàng tam đảo (Camellia tamdaoensis) Hình 02. Các mẫu lá Trà vàng lá dày (Camellia crassiphylla) Cặp mồi cho nhân bản đoạn gen matk được thiết kế dựa trên trình tự nucleotide của loài Trà vàng petêlô (Camellia petelotii) đã được công bố Ngân hàng gen Quốc tế NCBI (Mã số: KJ ): - Mồi xuôi matkthvf: 5 -TCCATGGGTTTATATGGATCCTTCCTGGTT-3 - Mồi ngược matkthvr: 5 -CCCGCCATGGATGGAAGAATTCAAAAGATA-3 Hóa chất: Các loại hóa chất phục vụ cho tách chiết ADN tổng số: CTAB, SDS, EDTA, Tris-HCl, NaCl, PVP, Ascorbic acid, Mercaptoethanol, Potassium acetate, Sodium acetate, Ethanol,... do các hãng Wako (Nhật bản) và Merck (Đức) cung cấp; Các hóa chất cho PCR: 10X Taq Reaction buffer, dntp mix (2,0 mm), Taq DNA polymerase (5 units/μl); Hóa chất cho điện di ADN: Agarose, Ethidium bromide, DNA marker và các hóa chất khác do các hãng Fermentas (Đức), Bioneer (Hàn quốc), Research Organics (Mỹ) cung cấp. Phương pháp nghiên cứu LD1 LD2 LD3 LD4 LD5 Tách chiết ADN tổng số từ các mẫu lá của cây Trà hoa vàng tam đảo và Trà vàng lá dày theo phương pháp của Keb-Llanes và cộng sự (2002). Xác định nồng độ và độ tinh sạch của dung dịch ADN tổng số bằng phương pháp quang phổ kế. Nhân bản đoạn gen matk từ các mẫu ADN 124

3 tổng số tách chiết từ lá cây Trà hoa vàng tam đảo bẵng kỹ thuật PCR trên máy PCR 9700 Thermal Cycler Applied Biosystems (Mỹ), mỗi phản ứng PCR được thực hiện trong tổng thể tích 25 μl, bao gồm: H 2 O deion (17 µl), 10X Taq Reaction buffer (2,5 µl), 2,0 mm dntp mix (2,0 µl), 10 µm mồi matkthvf (1,0 µl), 10 µm mồi matkthvr (1,0 µl), 5 U/µl Taq DNA polymerase (0,5 µl) và 50 ng/µl ADN khuôn (1 µl). Chương trình phản ứng PCR: 95 o C trong 3 phút; (95 o C: 30 giây, 57 o C : 30 giây, 72 o C : 1 phút) lặp lại 40 chu kỳ; 72 o C trong 7 phút; bảo quản sản phẩm PCR ở 4 o C. Mỗi phản ứng PCR lặp lại 3 lần trên mỗi mẫu thí nghiệm. Kết quả PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2 %, quan sát kết quả dưới đèn cực tím (UV) và chụp ảnh bằng hệ thống Dolphin - Doc Image system của hãng Wealtec (Mỹ). Tất cả các sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được sử dụng để giải trình tự. Trình tự nucleotide của đoạn gen matk được xác định tại bằng máy giải trình tự ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng bộ Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing ở Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm KH và CN Việt Nam. Các sản phẩm PCR sau khi giải trình tự, tiến hành so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen matk giữa các lần lặp lại (3 lần/1 mẫu), giữa các mẫu trong cùng loài (5 mẫu); giữa loài Trà hoa vàng tam đảo với loài trà vàng lá dày và loài trà vàng petêlô. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách ADN tổng số Hiện nay, có nhiều phương pháp tách chiết ADN tổng số khá hiệu quả. Trong nghiên cứu này sử dụng phương pháp của Keb Llanes et al., (2002) để tách chiết ADN tổng số từ các mẫu nghiên cứu. Chất lượng DNA tổng số (độ sạch và độ nguyên vẹn) sau khi tách chiết từ các mẫu nghiên cứu có ảnh hưởng nhiều đến kết quả phân tích ADN bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. ADN tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả thu được thể hiện trên hình 03. TĐ1 TĐ2 TĐ3 TĐ4 TĐ5 LD1 LD2 LD2 LD4 LD5 Hình 03: Kết quả điện di sản phẩm ADN tổng số từ 5 mẫu Trà hoa vàng tam đảo (TĐ1-TĐ5) và 5 mẫu Trà vàng lá dày (LD1-LD5) Từ kết quả điện di hình 03 cho thấy, băng điện di sáng rõ nét và chỉ có một băng vạch, chứng tỏ ADN tổng số nguyên vẹn, không bị đứt gãy và đã loại bỏ được ARN. Điều này, chứng tỏ phương pháp tách chiết là phù hợp với đối tượng Trà hoa vàng. ADN tổng số đáp ứng được yêu cầu phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo Kết quả nhân dòng đoạn gen matk ADN tổng số tách chiết từ 5 mẫu lá của cây Trà hoa vàng tam đảo và 5 mẫu Trà vàng lá dày được sử dụng làm khuôn để nhân bản đoạn gen matk ở lục lạp bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự nucleotide của của gen matk ở loài Camellia petelotii. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR như mô tả ở phần phương pháp. Tuy nhiên, lúc đầu sử dụng trực tiếp 1µl dung dịch ADN tổng số để làm khuôn cho nhân bản đoạn gen matk, thì kết quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di không xuất hiện băng ADN quan tâm. Chúng tôi cho rằng nồng độ ADN có ảnh hưởng đến hiệu quả nhân gen, vì vậy đã tiến hành thí nghiệm pha loãng dung dịch ADN tổng số thành các nồng độ: 200 ng/µl (pha loãng 10 lần), 40 ng/µl (pha loãng 50 lần) và 20 ng/µl (pha loãng 100 lần) sau đó tiến hành phản ứng PCR. Kết quả nhân đoạn gen matk bằng PCR sử dụng dung dịch ADN ở các độ pha loãng khác nhau như sau: 125

4 Hình 04. Kết quả nhân bản đoạn gen matk sử dụng ADN khuôn ở các độ pha loãng khác nhau Giếng 1: nồng độ ADN khuôn là ng/µl, giếng 2: 200 ng/µl, giếng 3: 40 ng/µl, giếng 4: 20 ng/µl Kết quả trên hình 04 cho thấy, sử dụng ADN tổng số ở nồng độ ng/µl (giếng 1) và 200 ng/µl (giếng 2) thì không thấy xuất hiện sản phẩm PCR. Dung dịch ADN pha loãng ở nồng độ 40 ng/µl (giếng 3) và 20 ng/µl (giếng 4) thì xuất hiện băng ADN đặc hiệu. Thí nghiệm này cho thấy nồng độ dung dịch ADN tổng số được sử dụng làm khuôn cho nhân gen bằng kỹ thuật PCR có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả nhân gen. Điều này có thể do trong dụng dịch ADN tổng số còn chứa nhiều tạp chất khác có thể gây ảnh hưởng đến sự biến tính của ADN khuôn, cản trở sự tiếp cận của mồi với ADN khuôn hoặc ức chế hoạt tính của enzyme Taq DNA polymerase, dẫn đến không nhân bản hoặc hiệu quả nhân bản gen thấp. Từ kết quả trên, chúng tôi sử dụng dung dịch ADN tổng số ở nồng độ 40 ng/µl để làm khuôn cho nhân bản gen matk ở các thí nghiệm tiếp theo. Sau khi xác định được nồng độ ADN phù hợp, tiến hành nhân bản gen matk từ ADN tổng số của 5 mẫu Trà hoa vàng tam đảo và 5 mẫu Trà vàng lá dày bằng phản ứng PCR với cặp mồi matthvf và matthvr. Thực hiện phản ứng PCR lặp lại 3 lần trên mỗi mẫu thí nghiệm. Sản phẩm PCR của tất cả các mẫu thí nghiệm được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,2%. Kết quả điện di sản phẩm PCR từ 5 mẫu Trà hoa vàng tam đảo và 5 mẫu Trà vàng lá dày được thể hiện trên hình 05 và 06. M bp Sản phẩm PCR 500 Hình 05. Kết quả nhân bản đoạn gen matk từ 5 mẫu Trà hoa vàng tam đảo 126

5 Sản phẩm PCR Hình 06. Kết quả nhân bản đoạn gen matk từ 5 mẫu Trà hoa vàng lá dầy Kết quả điện di sản phẩm PCR của tất cả các mẫu thí nghiệm cho thấy, ở các mẫu đều thu được một băng ADN sáng rõ nét, có kích thước khoảng 950 bp phù hợp với kích thước lý thuyết của đoạn gen matk dự kiến nhân bản. Kết quả điện di cũng cho thấy, không có băng ADN phụ xuất hiện, như vậy sản phẩn PCR nhân bản đoạn gen matk rất đặc hiệu, có thể sử dụng trực tiếp các sản phẩm này để xác định trình trình tự nucleotide Kết qủa xác định và phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen matk Tất cả các sản phẩm PCR của các mẫu nghiên cứu ( 5 mẫu Trà hoa vàng tam đảo x 3 lần lặp = 15 mẫu; 5 mẫu Trà vàng lá dày x 3 lần lặp = 15 mẫu) đã được xác định trình tự nucleotide. Kết quả xác định trình tự nucleotide của các sản phẩm PCR cho thấy, đoạn gen matk được nhân bản có kích thước là 951 nucleotide. Đã tiến hành so sánh trình tự nucleotide của các mẫu sản phẩm PCR ( 3 lần lặp/mẫu và 5 mẫu lấy từ 5 cây khác nhau), kết quả so sánh cho thấy không có sự khác biệt về trình tự nucleotide của đoạn gen matk ở các lần lặp lại và các mẫu trong cùng một loài. Tiến hành so sánh trình tự nucleotide của gen matk phân lập từ cây Trà hoa vàng tam đảo với trình tự nucleotide của đoạn gen matk ở cây Trà vàng lá dày và Trà vàng petêlô, kết quả so sánh cho thấy trình tự nucleotide của đoạn gen matk ở cây Trà hoa vàng tam đảo so với ở cây Trà vàng lá dày chỉ sai khác 1 nucleotide (thay A bằng G) ở vị trí 508, so với ở loài Trà vàng petêlô thì có 1 nucleotide sai khác (thay C bằng A) ở vị trí 613; so sánh trình tự nucleotide của gen matk ở Trà vàng lá dày so với trà vàng petêlô thì có 2 nucleotide sai khác là thay G bằng A ở vị trí 508 và thay C bằng A ở vị trí 613; kết quả so sánh được thể hiện trên hình C1_Petelo GTTTATATGG ATCCTTCCTG GTTGAGACCA CATGTAAAAA TAACATTGCC C2_Tamdao GTTTATATGG ATCCTTCCTG GTTGAGACCA CATGTAAAAA TAACATTGCC C3_Crassi GTTTATATGG ATCCTTCCTG GTTGAGACCA CATGTAAAAA TAACATTGCC C1_Petelo AGAAATTGAC AAGGTAAGAT TTCCATTTAT TCATCAAAAG AGACGTACCT C2_Tamdao AGAAATTGAC AAGGTAAGAT TTCCATTTAT TCATCAAAAG AGACGTACCT C3_Crassi AGAAATTGAC AAGGTAAGAT TTCCATTTAT TCATCAAAAG AGACGTACCT C1_Petelo TTTGAAGCCA AAATGTATTT TCCTTGATAC CTAACATAAT GAATAAAAGG C2_Tamdao TTTGAAGCCA AAATGTATTT TCCTTGATAC CTAACATAAT GAATAAAAGG C3_Crassi TTTGAAGCCA AAATGTATTT TCCTTGATAC CTAACATAAT GAATAAAAGG C1_Petelo ATCCTTGAAC AACCACAGAA TGACCTGAAA ATCCTTAGTA AAGACTTCTA C2_Tamdao ATCCTTGAAC AACCACAGAA TGACCTGAAA ATCCTTAGTA AAGACTTCTA C3_Crassi ATCCTTGAAC AACCACAGAA TGACCTGAAA ATCCTTAGTA AAGACTTCTA C1_Petelo AAAAATGTTC TATTTTTCCA TAGAAATATC TTCGTTCGAG AAAGGTTCCA C2_Tamdao AAAAATGTTC TATTTTTCCA TAGAAATATC TTCGTTCGAG AAAGGTTCCA C3_Crassi AAAAATGTTC TATTTTTCCA TAGAAATATC TTCGTTCGAG AAAGGTTCCA 127

6 C1_Petelo GAAGATATTG ATCGTAAATG AGAAGATTGC TTGCGGAGAA AAACGAAGAT C2_Tamdao GAAGATATTG ATCGTAAATG AGAAGATTGC TTGCGGAGAA AAACGAAGAT C3_Crassi GAAGATATTG ATCGTAAATG AGAAGATTGC TTGCGGAGAA AAACGAAGAT C1_Petelo GGATTCGTAT TCACATATAT GAAAATTATA TAGAAACAAG AATAATCTTT C2_Tamdao GGATTCGTAT TCACATATAT GAAAATTATA TAGAAACAAG AATAATCTTT C3_Crassi GGATTCGTAT TCACATATAT GAAAATTATA TAGAAACAAG AATAATCTTT C1_Petelo GATTTCTTTT TGAAAAATAA AAACTAGATT TCTTTGGAGT AATAAGACTA C2_Tamdao GATTTCTTTT TGAAAAATAA AAACTAGATT TCTTTGGAGT AATAAGACTA C3_Crassi GATTTCTTTT TGAAAAATAA AAACTAGATT TCTTTGGAGT AATAAGACTA C1_Petelo TTCCAATTCC AATACATATG GAGAAAGAAT CGTAATAAAT ACAAAGAAGA C2_Tamdao TTCCAATTCC AATACATATG GAGAAAGAAT CGTAATAAAT ACAAAGAAGA C3_Crassi TTCCAATTCC AATACATATG GAGAAAGAAT CGTAATAAAT ACAAAGAAGA C1_Petelo GGCATCTTTT ACCCAGTAAC GAAGAGTTTG AACCGAGATT TCCAGATGGA C2_Tamdao GGCATCTTTT ACCCAGTAAC GAAGAGTTTG AACCGAGATT TCCAGATGGA C3_Crassi GGCATCTTTT ACCCAGTAAC GAAGAGTTTG AACCGAGATT TCCAGATGGA C1_Petelo TGGAGTGGGG TATTAGTATA TCTAACACAT AATTTAGATG TGAAAATTTG C2_Tamdao TGGAGTGGGG TATTAGTATA TCTAACACAT AATTTAGATG TGAAAATTTG C3_Crassi TGGAGTGAGG TATTAGTATA TCTAACACAT AATTTAGATG TGAAAATTTG C1_Petelo TCCTCTAAAA AAGGAAATAT TGAATGAATT GATCGTAAAT TTTGAGATTT C2_Tamdao TCCTCTAAAA AAGGAAATAT TGAATGAATT GATCGTAAAT TTTGAGATTT C3_Crassi TCCTCTAAAA AAGGAAATAT TGAATGAATT GATCGTAAAT TTTGAGATTT C1_Petelo CACTATTTCT TTCCCTTCTA GGGAAAATAG AGAAAATGGA ATTTCCACAA C2_Tamdao CACTATTTCT TTACCTTCTA GGGAAAATAG AGAAAATGGA ATTTCCACAA C3_Crassi CACTATTTCT TTACCTTCTA GGGAAAATAG AGAAAATGGA ATTTCCACAA C1_Petelo CGGCTACAAA TCCTTCTAAT ATCATTTGAG AATACAAATT CGTGTTGTGC C2_Tamdao CGGCTACAAA TCCTTCTAAT ATCATTTGAG AATACAAATT CGTGTTGTGC C3_Crassi CGGCTACAAA TCCTTCTAAT ATCATTTGAG AATACAAATT CGTGTTGTGC C1_Petelo CCAAAAAATG GATTTTGGTT AGAATCATTA GCAGAAAAAA GAAAATGATT C2_Tamdao CCAAAAAATG GATTTTGGTT AGAATCATTA GCAGAAAAAA GAAAATGATT C3_Crassi CCAAAAAATG GATTTTGGTT AGAATCATTA GCAGAAAAAA GAAAATGATT C1_Petelo CTGTTGATAC ATTTGAGTAA TTAAATGTTT CACAATTAGT AAGCTGAATT C2_Tamdao CTGTTGATAC ATTTGAGTAA TTAAATGTTT CACAATTAGT AAGCTGAATT C3_Crassi CTGTTGATAC ATTTGAGTAA TTAAATGTTT CACAATTAGT AAGCTGAATT C1_Petelo TATTGTCATA ACCTATATTT TCCAAAAAAA TCGATCTAGT TAAACCATGA C2_Tamdao TATTGTCATA ACCTATATTT TCCAAAAAAA TCGATCTAGT TAAACCATGA C3_Crassi TATTGTCATA ACCTATATTT TCCAAAAAAA TCGATCTAGT TAAACCATGA C1_Petelo TCATGAGCAA GTGCATAAAT ATACTCCTGA AAGATAAGTG GATATACGAA C2_Tamdao TCATGAGCAA GTGCATAAAT ATACTCCTGA AAGATAAGTG GATATACGAA C3_Crassi TCATGAGCAA GTGCATAAAT ATACTCCTGA AAGATAAGTG GATATACGAA

7 C1_Petelo GTCGTGTTGC TGAGATCTAT CTAGTTCTAA ATATCTTTTG AATTCTTCCA C2_Tamdao GTCGTGTTGC TGAGATCTAT CTAGTTCTAA ATATCTTTTG AATTCTTCCA C3_Crassi GTCGTGTTGC TGAGATCTAT CTAGTTCTAA ATATCTTTTG AATTCTTCCA C1_Petelo T C2_Tamdao T C3_Crassi T Hình 07. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen matk ở cây Trà hoa vàng tam đảo, Trà vàng lá dày và Trà vàng petêlô; Dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matk ở cây Trà hoa vàng tam đảo và Trà vàng lá dày đã xác định được, sử dụng công cụ Blast và Blast Tree View trong NCBI để tạo cây quan hệ di truyền với 8 loài trà khác đã được công bố trên NCBI là: Camellia petelotii (KJ806276), Camellia yunnanensis (KF156838), Camellia oleifera (JQ975031), Camellia sinensis (AJ429305), Camellia taliensis (KF156839), Camellia japonica (AF380074), Camellia cuspidata (KF156833), Camellia albogigas (AF380072). Kết quả thể hiện ở hình 07. Kết quả ở hình 07 cho thấy loài Trà hoa vàng tam đảo (Mã số KP241692) ở một nhánh riêng, loài Trà vàng lá dày có quan hệ gần với loài Camellia japonica (AF380074). Hình 08. Cây quan hệ di truyền giữ Trà hoa vàng tam đảo với các loài khác đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế NCBI Do đây là lần đầu tiên trình tự nucleotide của đoạn gen matk ở cây Trà hoa vàng tam đảo được giải mã, vì vậy chúng tôi đã tiến hành đăng ký trình tự nucleotide của đoạn gen matk ở cây Trà hoa vàng tam đảo trong ngân hàng gen Quốc tế (NCBI) với mã số đăng ký KP KẾT LUẬN Đã nhân bản thành công đoạn gen matk từ nguồn ADN tổng số của loài Trà hoa vàng bằng kỹ thuật PCR. Đã xác định được trình tự nucleotide của đoạn gen matk của các mẫu sản phẩm PCR có kích thước 951 bp, kết quả so sánh cho thấy không có sự khác biệt về trình tự nucleotide của đoạn gen matk ở các lần lặp lại và các mẫu trong cùng một loài. Trình tự đoạn gen matk phân lập được có thể là một trong các chỉ thị dùng để phân loại các loài trà hoa vàng cùa việt Nam. 129

8 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Anders R., (2012). DNA barcoding as a tool for the identifcation of unknown plant material: A case study on medicinal roots traded in the medina of Marrakech. M.SC thesis, Uppsala University CBOL ABS Brochure. 2. Aron J.F, Kevin S.B, Prasad R.K et al (2008). Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well. PLoS ONE, 3(7): e Chase M.W, et al., (2005). Land plants and DNA barcodes: Short-term and long-term goals. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360: Ford C.S, Ayres K.L, Toomey N et al., (2009). Selection of candidate coding DNA barcoding regions for use on ADN plants. Botanical Journal of the Linnean Society, 159 (1): Hakoda N, Kirino Sh, Ninh T., (2007). New species of genus Camellia in Vietnam. International Camellia Journal, 39: Kress J.W, Erickson D.L. (2008). DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics. Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8): Kress J.W, Wurdack K.J, Zimmer E.A, Weigt L.A, Janzen D.H., (2005). Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23): Ninh T., (2003). Results of study on yellow Camellias of Vietnam. International Camellia Journal. 9. Ninh T., (2007). Diversity of wild Camellia species of Tam Dao Nationnal Park. Journal of Science Natural Science and Technology, 23: Olmstead R.G, Palmer J.D., (1994). Chloroplast DNA Systematics: A review of methods and Data Analysis. American Journal of Botany, 81: Spooner D.M., (2009). DNA barcoding will frequently fail in complicated groups: an example in wild potatoes. Am. J. Bot, 96: Storchova H, Olson MS., (2007). The architecture of the chloroplast psba -trnh non coding region in angiosperms. Plant systematic and evolution. Biomedical and life sciences, 268: Trần Ninh, Hakoda Naotoshi (2010). Các loài trà ở vườn Quốc gia Tam đảo: Yakawa M, Tsudzuki T, Sugiura M., (2006). The chloroplast genome of Nicotianas sylvestris and Nicotian tomentosisformis: complete sequencing confirms that the Nicotiana sylvestris progenitor is the maternal genome donor of Nicotiana tabacum. Mol genet genomics, 275: IDENTIFICATION OF DNA BARCODE SEQUENCE FOR TAM DAO YELLOW TEA (Camellia tamdaoensis): AN ENDEMIC PLANT SPECIES OF VIETNAM Ha Van Huan, Nguyen Van Phong SUMMARY College of Forestry Biotechnology Vietnam Forestry University Base on the information of matk gene of Camellia petelotii (Accession no. KJ ) was published, one primer pair was designed to amplify matk gene from total DNA of Camellia tamdaoensis (TĐ1,TĐ2, TĐ3, TĐ4 và TĐ5) and Camellia crassiphylla (LD1, LD2, LD3, LD4 và LD5) by PCR. The PCR results indicated that all DNA bands were amplified from the samples, they have the same size of approximately 950bp, similar to the theoretical size of matk gene of Camellia petelotii species. Results nucleotide sequencing of PCR product samples (repeated three times / a sample and 5 samples / a species ) showed that the size of the isolated matk gene was 951 bp, comparison of nucleotide sequences of the PCR product samples show that there is no difference between repeated three times and samples in the same species. The nucleotide sequence of the matk gene from Camellia tamdaoensis was compared with the nucleotide sequence of the matk gene from Camellia crassiphylla and Camellia petelotii. The result comparison between Camellia tamdaoensis and Camellia crassiphylla showed that only one nucleotide is various in 508 site (A was replaced by G); between Camellia tamdaoensis and Camellia petelotii that one nucleotide is various in 613 site (C was replaced by A); between Camellia crassiphylla and Camellia petelotii that two nucleotide are various in 508 and 613 site. The nucleotide sequences of isolated matk gene of Camellia tamdaoensis and Camellia crassiphylla have been registered on the NCBI with Accession no. KP and KP This sequence can be one of the markers used to identify the yellow flower tea species of Vietnam. Key words: Camellia tamdaoensis, DNA barcode, matk gene, species identification, yellow tea. 130