Bakteriaalselt saadud puutumata minirakud, mis sisaldavad plasmiidivaba funktsionaalset nukleiinhapet in vivo imetajarakkudesse transpordiks

Transcription

1

2 Bakteriaalselt saadud puutumata minirakud, mis sisaldavad plasmiidivaba funktsionaalset nukleiinhapet in vivo imetajarakkudesse transpordiks TEHNIKA TASE Välja on töötatud hulk nukleiinhappepõhiseid strateegiaid erinevate tsellulaarsete funktsioonide moduleerimiseks (Opalinska ja Gewirtz, 02). Oma väga spetsiifilise toime tõttu pakuvad uuringuteks huvi oligonukleotiidide klassid nagu aptameerid, transkriptsioonifaktorit siduvad peibutis-oligonukleotiidid, ribosüümid, kolmikahelaid moodustavad oligonukleotiidid, immuunsust stimuleerivad CpG motiivid, antisense-oligonukleotiidid (k.a peptiidi nukleiinhapped), väikesed interfeeruvad RNA-d ja mikrorna-d. Need oligomeersed nukleiinhapped omavad samuti märkimisväärset potentsiaali ravimitena. Kuid sellistel ravimitel esineb suuri miinuseid, k.a vabade nukleiinhapete ebastabiilsus ning nende makromolekulide ohutu, efektiivse ja suunatud tsellulaarse transpordi raskus (Dykxhoorn ja Lieberman, 0). Paljude nukleiinhappepõhiste terapeutiliste strateegiate aluseks on RNA interferentsi (RNAi) fenomen, kus rakkudes olev pikk kaheahelaline RNA (dsrna) põhjustab homoloogsete (komplementaarsete või osaliselt komplementaarsete) geeni transkriptide järjestuse-spetsiifilise degradatsiooni. Täpsemalt, pikad dsrna molekulid töödeldakse endogeense ribonukleaasi nimega "Dicer poolt väiksemateks RNA-deks (Grishok et al., 00; Zamore et al., 00). Väiksemaid RNA-sid teatakse kui lühikest interfeeruvat RNA-d" (sirna) (juhul kui need pärinevad eksogeensetest allikatest) ja kui "mikrorna-d" (mirna) (juhul, kui need pärinevad raku enda genoomi RNA-d kodeerivatest geenidest). Need kaks väikeste reguleerivate RNA-de klassi (tavaliselt 21 - kuni 23-nukleotiidi) erinevad üksteisest samuti selle alusel, et mirna-d omavad ainult osalist komplementaarsust messenger-mrna (mrna) märklaudade suhtes. Lühikesed reguleerivad RNA-d seonduvad nn RNA-indutseeritud vaigistava kompleksiga (RISC), millel on helikaasi aktiivsus ja endonukleaasi aktiivsus. Helikaasi aktiivsus kerib lahti RNA molekulide kaks ahelat, võimaldades antisenseahelal märklauaks oleva RNA molekuliga seonduda (Zamore et al., 00; Zamore,

3 2 02; Vickers et al., 03). Endonukleaasi aktiivsus hüdrolüüsib märklaud-rna piirkonnas, kus antisense-ahel on seotud. RNAi-s seondub üheahelaline RNA molekul (ssrna) seega märklauaks oleva RNA molekuliga Watson-Cricki aluspaardumise reeglite alusel ning mobiliseerib ribonukleaasi, mis märklauaks oleva RNA lagundab. Samas geeni ekspressiooni antisense-supressioon toob kaasa ssrna seondumise mrna-ga, blokeerides translatsiooni ilma mrna degradatsiooni katalüseerimata. Klassina omavad reguleerivad RNA-d poolestusaega, mille pikkuseks inimese plasmas on vähem kui tund (Layzer et al., 04) ning need väljutatakse plasmast kiiresti kinaaside poolt. Seega on mitmed teadlaste rühmad üritanud luua reguleerivaid RNA-sid, k.a sirna-sid, mis oleksid nukelaasi-resistentsed. Selliste katsete näideteks on nukleotiidide keemiline modifitseerimine (näiteks 2 -F, 2 - OMe, lukustatud nukleiinhapped; LNA) või fosfodiestrist struktuur, näiteks fosforotioaadi ühendused (Chiu ja Rana 03; Choung et al., 06; Czauderna et al., 03; Elmén et al., 0; Layzer et al., 04; Morrissey et al., 0). Aja, mille vältel sirna-d või muud reguleerivad RNA-d vereringes püsivad, minimeerimiseks on RNA molekule soovitud imetajarakkudesse suunamiseks proteiinide ja antikehadega konjugeeritud. Vähesest stabiilsusest ja kiirest neerude kaudu väljutamisest tingitud probleemide lahendamiseks on välja töötatud transpordivahendid reguleerivate RNA-de transpordiks. Uuritud on ka polüplekse (moodustunud läbi nukleiinhapete kokkuühendumise polükatioonidega), lipopolüplekse (moodustunud läbi nukleiinhappe algse kondensatsiooni polükatioonidega ning sellele järgneva katioonsete lipiidide lisamisega), liposoome ja sünteetilisi nanoosakesi. Nende meetodite korral on põrkutud samuti erinevatele takistustele, näiteks (a) transpordivalkude kiirele eemaldamisele seerumist läbi neerudes toimuva ekskretsiooni; (b) reguleerivate RNA molekulide, mille ig a transpordivalguga konjugeerida saab, piiratud arvule; (c) terviklike reguleerivate RNA -de intratsellulaarse dissotsiatsiooni raskusele transpordivalgust; (d) kiirele organismist eemaldamisele, mis on tingitud polüplekse siduvatest seerumi proteiinidest, mis võivad toimida opsoniinidena (Dash et al., 1999) ja (e) liposoomide

4 3 ebastabiilsusest in vivo, mis põhjustab nukleiinhapete vabanemist seerumisse ja potentsiaalset mittespetsiifilist transformatsiooni. Reguleerivate RNA-de endogeenseks tootmiseks on välja töötatud ka viiruse vektorid. Vaadake näiteks Devroe ja Silver, 04. Kuid need viiruse vektorid kujutavad endast tõsist ohtu patsiendi tervisele. Probleemide näideteks on rekombinatsioon metsiktüüp-viirustega, insertsionaalse ja onkogeense potentsiaaliga viiruse indutseeritud immuunvastuse mahasurumine, viiruse vektorite piiratud võimekus suuri DNA segmente kanda, nõrgendatud viiruste virulentsuse ümberpööramine, raskused tootmisel ja tarnimisel, madal stabiilsus ja kahjulikud kõrvaltoimed (Hacein-Bey-Abina et al., 03; Kootstra ja Verma, 03; Raper et al., 03; Verma ja Weitzman, 0; Check, 0). Reguleeriva RNA nagu sirna või suurema (~70 nukleotiidi) lähteaine, lühikese juuksenõela RNA (shrna) rekombinantseks in situ ekspressiooniks on töötatud välja ka plasmiidipõhised süsteemid. shrna sisaldab märklaudgeenist pärinevaid sense- ja antisense-järjestusi, mis on ühendatud omavahel juuksenõela linguga. Vaadake näiteks Paddison et al., 02. shrna-de ekspressioon võib toimuda pol- III-tüüpi promootorist või mirna-de kontekstis pol II promootoritega. Vastavalt rahvusvahelises patenditaotluses WO 03/03319 kirjeldatule saab shrna, sirna või muu reguleeriva RNA jaoks kodeerivad plasmiidid transformeerida mutatsiooni, mis põhjustab asümmeetrilist rakkude jagunemist, kaudu bakterite lähtetüveks, mis toodab terviklikke minirakke. Selline transformatsioon annab rekombinantsed bakterid, kus plasmiid replitseerub intratsellulaarselt, sisestades bakteri tsütoplasmasse suures koguses plasmiide. Asümmeetrilise jagunemise käigus eralduvad mõned plasmiidid minirakkude tsütoplasmasse, andes seeläbi rekombinantsed minirakud. Minirakud on suutelised transportima plasmiidi DNA imetajarakkudesse, kus plasmiidi DNA migreerub rakutuuma. Tuumas avaldab plasmiidi DNA vastavalt olukorrale shrna-d või muud reguleerivat RNA-d ning saadud nukleiinhape liigub seejärel tsütoplasmasse, kus see suudab mõjutada sõltuvalt osaleva reguleeriva RNA olemusest RNAi või geenide supressiooni.

5 4 Kuid selliste meetodite korral on vajalik, et peremehe mehhanismid transpordiksid nukleiinhappe terapeutiliselt efektiivseid koguseid läbi ekspressioonipõhiste süsteemide, mis hõlmavad keerulisi ja pikaldasi protsesse, piirates seeläbi nende meetodite efektiivsust. Seega on funktsionaalsete nukleiinhapete nagu reguleerivate RNA-de märklaudrakkudesse transpordiks vaja efektiivsemaid meetodeid. Patendis WO 06/ on kirjeldatud RNA molekulide transporti imetajarakkudesse bakteritest deriveeritud minirakke kasutades. Täpsemalt, selle patendi näidetes on avaldatud RNA järjestust kodeerivad plasmiidid, mis transformeeriti bakterirakkudesse. Saadud rekombinantsed bakterirakud tekitasid seeläbi minirakud, mis plasmiide vastu võtsid ning plasmiide sisaldavad minirakud omastati omakorda imetajarakkude poolt, kus need plasmiidid vabastati, põhjustades seeläbi RNA järjestuse transkriptsiooni imetajarakkudes. LEIUTISE KOKKUVÕTE Käesoleva patendi ühe teostuse alusel sisaldab koostis (a) terviklike bakteritest deriveeritud minirakkude hulka, kus nimetatud hulga iga minirakk sisaldab reguleerivat RNA-d, mis on nimetatud minirakku sisestatud; ja (b) farmatseutiliselt sobivat tugiainet ning nimetatud minirakkudes puudub konstruktsioon nimetatud reguleeriva RNA in situ ekspressiooniks ja nimetatud reguleeriv RNA on valitud rühmast, kuhu kuuluvad sirna, mirna ja shrna ning nimetatud hulk sisaldab nimetatud reguleeriva RNA terapeutiliselt efektiivset kogust. Minirakkudesse sisestatud funktsionaalne nukleiinhape võib olla suunatud RNA transkriptidele, mis kodeerivad proteiini, mis omakorda tekitab ravimiresistentsust, apoptoosiresistentsust või neoplastilisust. Leiutise koostis võib sisaldada lisaks bispetsiifilist ligandit, mis koosneb näiteks esimesest harust, mis on miniraku rakupinna struktuuri spetsiifiline, ja teisest harust, mis on mittefagotsüütse imetajaraku rakupinna retseptori spetsiifiline. Käesolevas patendis on avaldatud meetod funktsionaalse nukleiinhappe märklaud-imetajarakku transportimiseks. Leiutise meetod kujutab endast (a) terviklike minirakkude hulga loomist farmatseutiliselt sobivas tugiaines ning iga

6 nimetatud hulga minirakk sisaldab plasimiidivaba funktsionaalset nukleiinhapet; ja (b) nimetatud hulga minirakkude viimist kontakti imetajarakkudega nii, et nimetatud imetajarakud neelavad hulga moodustavad minirakud ning seeläbi vabaneb funktsionaalne nukleiinhape märklaudrakkude tsütoplasmasse. Nagu eespool mainitud, võib reguleeriv RNA nagu sirna, mirna või shrna olla suunatud RNA transkriptidele, mis omakorda kodeerivad proteiini, mis tekitab ravimiresistentsust, apoptoosiresistentsust või neoplastilisust. Muudes teostustes sisaldab see metoodika lisaks funktsionaalsest nukleiinhappest erineva ravimi transporti märklauaks olevatesse imetajarakkudesse. Ravimi saab manustada pärast, koos või isegi enne minirakkude koostise manustamist. Veel ühe käesoleva patendi teostuse alusel kirjeldatakse käesolevas patendis meetodit minirakkude formuleerimiseks leiutise koostiseks. Nimetatud meetod kujutab endast (A) terviklike bakteritest deriveeritud minirakkude hulga inkubeerimist koos (B) plasmiidivaba reguleeriva RNA-ga puhvris, saades seeläbi nimetatud reguleerivat RNA-d sisaldavad minirakud ning nimetatud reguleeriv RNA on valitud rühmast, kuhu kuuluvad sirna, mirna ja shrna. Mõningates käesoleva leiutise teostustes võib koos inkubeerimisega kaasneda ka õrn segamine, samas kui muudes teostustes on koos inkubeerimine staatiline. Mõningates käesoleva leiutise teostustes kestab koos inkubeerimine umbes minutit, samas kui mõningates teostustes on inkubeerimise kestuseks 1 tund. Ühes käesoleva leiutise teostuses on puhvriks puhverdatud soolalahus, näiteks 1X fosfaatpuhvri lahus. Veel ühes käesoleva leiutise teostuses toimub koos inkubeerimine temperatuurivahemikus umbes 4 C kuni umbes 37 C, umbes C kuni umbes C või umbes C või umbes 37 C. Koos inkubeerimiseks võib kasutada umbes 7, 8, 9,, 11, 12 või 13 minirakku. Muud siin kirjeldatud eesmärgid, omadused ja eelised muutuvad selgemaks pärast järgneva detailse kirjelduse lugemist. Detailne kirjeldus ja konkreetsed näited on lisatud kõigest illustreerival eesmärgil, kuna eriala spetsialist mõistab pärast lisatud detailse kirjelduse lugemist, et leiutise piirides on võimalikud erinevad muutused ja modifikatsioonid. Lisaks demonstreeritakse näidetega leiutise põhimõtet ning seega ei saa eeldada, et näited illustreeriksid täpselt käesoleva

7 6 leiutise kõiki näitlikke kasutamisvõimalusi olukordades, kus need valdkonnas varasemaid teadmisi omavatele isikutele kasulikud oleksid. JOONISTE LÜHIKIRJELDUS Joonisel Fig 1 on kujutatud terviklikke minirakke, millesse on lisatud Cy3 flurofooriga märgistatud sirna. Joonisel Fig 1A on kujutatud valgusmikroskoobi ülesvõtet, samas kui joonisel Fig 1B on kujutatud sama alust, kuid vaadatuna fluorestsentsvalguse all -60 ergastusfiltriga, paljastades tugeva fluorestsentsiga sirna molekulid, mis langevad kokku minirakkudega. Joonisel Fig 2 on kujutatud pilti, mis on võetud fluorestsentsi konfokaalse mikroskoopiaga, millel on näidatud EGFR-suunatud, sirna-pik1-sisaldavate minirakkude adhesiooni ja internalisatsiooni inimese rinnavähi rakkudesse in vitro. Joonisel Fig 3 on kujutatud graafiliselt märkimisväärset tuumorivastast toimet, mis on saavutatud läbi inimese rinnavähi (MDA -MB-468) karvadeta hiirtes olevate ksenotransplantaatide töötlemise EGFR-suunatud KSP-siRNA-d sisaldavate minirakkudega. Kontrollgrupile 1(- -) manustati steriilset soolalahust, samas kui katsegrupp 2 ( ) sai neli korda nädalas EGFR minirakke sirna-ksp ( 9 ). Joonisel Fig 4 on kujutatud graafiliselt märkimisväärset tuumorivastast toimet, mis on saavutatud läbi inimese käärsoole vähi (HCT116) karvadeta hiirtes olevate ksenotransplantaatide töötlemise EGFR-suunatud KSP-siRNA-d sisaldavate minirakkude ja EGFR-suunatud karboplatiini sisaldavate minirakkudega. Grupi 1 (- -) hiirtele manustati steriilset soolalahust ning gruppide 2 (--Δ--), 3 ( ) ja 4 ( ) hiired said esimese annusena vastavalt (vaadake joonist Fig 4) 9 EGFR minirakku sirna-plk1, EGFR minirakku sirna-ksp-1 ja EGFR minirakku sirna-ksp-2. Joonisel Fig on kujutatud erinevatel transfektsiooni järgsetel aegadel sooritatud käärsoole kasvaja (HCT116) rakkude, mida on ravitud eksperimentaalsete minirakkude, EGFRminirakkude sirna-ksp või EGFR minirakkude sirna-plk1, FACS analüüsi. Joonistel Fig A-D on kujutatud proovide, mis on kogutud 4 tundi pärast transfektsiooni, FACS analüüsi, samas kui joonistel Fig E-H on kujutatud proovide, mis on kogutud 8 tundi pärast transfektsiooni, analüüsi tulemusi. Joonistel Fig A ja E on kujutatud ainult rakkudega saadud tulemusi, samas kui

8 7 joonistel Fig B ja F on kujutatud rakke + tühjasid EGFR minirakke. Joonistel Fig C ja G on kujutatud rakkude + EGFR minirakkude sirna-ksp tulemusi ning joonistel Fig D ja H on kujutatud rakkude + EGFR minirakkude sirna-pik1 kasutamisel saadud tulemusi. Joonisel Fig 6 on kujutatud erinevatel transfektsiooni järgsetel aegadel sooritatud käärsoole kasvaja (HCT116) rakkude, mida on ravitud eksperimentaalsete minirakkude, EGFRminirakkude sirna-ksp või EGFR minirakkude sirna-plk1, FACS analüüsi. Joonistel Fig 6A-6D on kujutatud proovide, mis on kogutud 16 tundi pärast transfektsiooni, FACS analüüsi, samas kui joonistel Fig 6E-6H on kujutatud proovide, mis on võetud 24 tundi pärast transfektsiooni, analüüsi tulemusi. Joonistel Fig 6A ja 6E on kujutatud ainult rakkudega saadud tulemusi, samas kui joonistel Fig 6B ja 6F on kujutatud rakke + tühjasid EGFR minirakke. Joonistel Fig 6C ja 6G on kujutatud rakkude + EGFR minirakkude sirna x KSP tulemusi ning joonistel Fig 6D ja 6H on näidatud rakkude + EGFR minirakkude sirna-pik1 tulemusi. Joonisel Fig 7 on kujutatud erinevatel transfektsiooni järgsetel aegadel sooritatud käärsoole kasvaja (HCT116) rakkude, mida on ravitud eksperimentaalsete minirakkude, EGFRminirakkude sirna-ksp või EGFR minirakkude sirna-plk1, FACS analüüsi. Joonistel Fig 7A-7D on kujutatud proovide, mis on kogutud 32 tundi pärast transfektsiooni, FACS analüüsi, samas kui joonistel Fig 7E-7H on kujutatud proovide, mis on võetud 48 tundi pärast transfektsiooni, analüüsi tulemusi. Joonistel Fig 7A ja 7E on kujutatud ainult rakkudega saadud tulemusi, samas kui joonistel Fig 7B ja 7F on kujutatud rakke + tühjasid EGFR minirakke. Joonistel Fig 7C ja 7G on kujutatud rakkude + EGFR minirakkude sirna x KSP tulemusi ning joonistel Fig 7D ja 7H on näidatud rakkude + EGFR minirakkude sirna-pik1 tulemusi. LEIUTISE DETAILNE KIRJELDUS Käesoleva patendi kohaselt saab reguleeriva RNA terapeutiliselt efektiivse koguse sisestada minirakkudesse tugevaid kemikaale või elektroporatsiooni kasutamata. Selleks on välja töötatud lihtne metoodika selliste reguleeriva RNA terapeutiliselt efektiivsete kontsentratsioonide liitmiseks terviklikesse minirakkudesse ja nimetatud meetod ei hõlma plasmiidipõhiseid ekspressioonikonstruktsioone või peremehest bakteriraku ekspressioonimehhanisme. Seega ei kloonita reguleerivat

9 8 RNA-d kodeerivat polünukleotiidi segmenti plasmiidi DNA-sse või viiruse vektorisse. Selle asemel liidetakse plasmiidivabad funktsionaalsed nukleiinhapped otse minirakkudesse, juhtides need läbi miniraku tervikliku membraani. Lisaks saab käesoleva leiutise minirakkude koostis transportida märklauaks olevatesse imetajarakkudesse ohutult ja efektiivselt reguleerivate RNA-de nagu sirna-de, mirna-de ja shrna-de terapeutiliselt efektiivseid koguseid. Definitsioonid Juhul, kui ei ole teisiti defineeritud, omavad kõik siin kasutatud tehnilised ja teaduslikud mõisted leiutise valdkonna asjatundjale mõistetavaid tähendusi. Mugavuse mõttes on alljärgnevalt avaldatud mõningate mõistete ja fraaside, mida käesoleva patendi kirjeldavas osas, näidetes ja patendinõudluses kasutatud on, tähendused. Muud mõisted ja fraasid on defineeritud käesoleva patendi erinevates osades. Ainsuse vormid hõlmavad juhud, kui kontekst ei näita vastupidist, ka viiteid mitmusele. Antisense-oligonukleotiid tähistab nukleiinhappe molekuli, mis on kindla geeni transkripti osa suhtes komplementaarne, suutes transkriptiga hübridiseeruda ja selle translatsiooni blokeerida. Antisense-oligonukleotiid võib sisaldada RNA-d või DNA-d. Biomolekulaarne järjestus või järjestus tähistab kogu või osa polünukleotiid- või polüpeptiidjärjestusest. "Kasvaja", "neoplasm", "tuumor", "pahaloomuline kasvaja" ja "kartsinoom" on käesolevas patendis samatähenduslikud ning tähistavad rakke või kudesid, kus avaldub ebanormaalne kasvu fenotüüp, mida omakorda iseloomustab märkimisväärne rakkude proliferatsioonikontrolli kadumine. Käesoleva leiutise meetodid ja ravimkoostised on eriti sobivad pahaloomuliste, metastaasi-eelsete, metastaatiliste ja mittemetastaatiliste rakkude ravimiseks. Komplementaarsus tähistab kahe molekuli nagu sirna molekuli ja selle märklauaks oleva mrna vastastoimes pindade topoloogilist ühilduvust või kokku

10 9 sobivust. Selliseid molekule saab kirjeldada kui komplementaarseid ning lisaks on kontaktpinna omadused üksteise suhtes komplementaarsed. Vastab või kujutab tähistab näiteks polünukleotiidi või järjestuse kontekstis, mis vastab või kujutab geeni, kasutatuna, et geen või nukleiinhappe geeniprodukt nagu mrna sisaldab polünukleotiidi järjestust. Polünuleotiid võib olla geeni genoomse järjestuse eksonis täielikult esindatud või võivad polünukleotiidi järjestuse erinevad osad asuda erinevates eksonites nii, et mrna sisaldab katkematut polünukleotiidjärjestust (enne või pärast splaissimist), mis on geeni ekspressioonisaaduseks. Peibutis-RNA on molekul, mis suudab tekitada endale struktuuri, mis on identne märklauaks oleva RNA olulise funktsionaalse piirkonnaga. Mainitud RNA võib olla imetajast peremehele või patogeenile, mis on imetajaraku nakatanud, näiteks HIVle, omane. Peibutis-RNA sekvestreerib proteiini, mis tavaolukorras märklauaks oleva RNA-ga interaktsioonis on, põhjustades seeläbi imetajast või patogeenist peremehe tavapäraste protsesside häirituse. Ravimiks võib olla iga füsioloogilise või farmakoloogilise aktiivsusega aktiivaine, mis tekitab loomades ja eriti imetajates ning inimestes lokaalse või süsteemse toime. Ekspressioon tähistab üldiselt protsessi, mille käigus läbib polünukleotiidjärjestus edukalt transkriptsiooni ja translatsiooni tasemeni, mis võimaldab aminohappejärjestuse või valgu tuvastatavate tasemete avaldumist. Käesoleva leiutise täpsemas kontekstis tähistab ekspressioon mrna tootmist. Muudes teostustes tähistab ekspressioon valgu tootmist. Funktsionaalseks nukleiinhappeks on nukleiinhappe molekul, mis sekkub pärast peremeesrakku sisestamist spetsiifiliselt valgu ekspressiooni. Funktsionaalsete nukleiinhappe molekulid on üldiselt võimelised valgu ekspressiooni vähendamiseks läbi otsese interaktsiooni valku kodeeriva transkriptiga. Funktsionaalsete nukleiinhapete näideteks on reguleeriv RNA nagu sirna, shrna, lühike RNA (tavaliselt lühem kui 400 alust), mikro -RNA-d (mirna), ribosüümid ja peibutis-rna-d ning antisense-nukleiinhapped.

11 Geen tähistab polünukleotiidjärjestust, mis sisaldab polüpeptiidi või lähteühendi tootmiseks vajalikke kontroll- ja kodeerimisjärjestusi. Polüpeptiidi võidakse kodeerida täispika kodeerimisjärjestuse või kodeerimisjärjestuse mistahes osa poolt. Geen võib kujutada endast katkematut kodeerimisjärjestust või sisaldada ühte või mitut intronit, mis on liidetud omavahel sobivate splaissimispiirkondadega. Lisaks võib geen sisaldada kodeerimispiirkondades või transleerimata piirkondades ühte või mitut modifikatsiooni, mis võivad mõjutada ekspressioonisaaduse keemilist struktuuri või bioloogilist aktiivsust, ekspressioonikiirust või ekspressioonikontrolli meetodit. Selliste modifikatsioonide näideteks on ühe või mitme nukleotiidi mutatsioonid, insertsioonid, deletsioonid ja asendused. Selle põhjal võidakse selliseid modifitseeritud geene lugeda loodusliku geeni variantideks. Peremeesrakk tähistab rakku, mis võib olla või olnud kasutusel rekombinantse plasmiidi või muu polünukleotiidide siirde adressaadina ja sisaldab transfekteeritud lähteraku järgmist põlvkonda. Üksiku raku järgmine põlvkond ei pruugi olla loomuliku või tahtmatu mutatsiooni tõttu lähteraku DNA komplemendiga morfoloogiliselt või genoomselt täielikult identne. Hübridisatsioon tähistab iga protsessi, mille abil polünukleotiidjärjestus läbi aluspaaride moodustamise komplementaarse järjestusega seondub. Mõisteid isik, katsealune, peremees ja patsient kasutatakse käesolevas patendis samatähenduslikult ning need tähistavad iga imetajast patsienti, kelle jaoks diagnoos, ravi või teraapia soovitav on. Ühes eelistatud teostuses on patsiendiks inimene. Muudeks patsientide näideteks on kariloomad, hobused, koerad, kassid, merisead, küülikud, rotid, primaadid ja hiired. Märgis tähistab aineid, mis on võimelised tekitama otse või läbi interaktsiooni ühe või mitme täiendava signaali tekitava süsteemi liikmega tuvastatava signaali. Märgiste, mis on otse tuvastatavad ja käesolevas leiutises kasutamiseks sobivad, näideteks on fluorestsentsmärgised. Fluorofooride näideteks on fluorestseiin, rodamiin, BODIPY, tsüaniinvärvained jne. Käesolevas leiutises vaadeldakse samuti radioaktiivsete isotoopide nagu 3 S, 32 P, 3 H jne kasutamist märgistena. Kasutada saab ka kolorimeetrilisi märgiseid nagu kolloidset kulda või värvitud

12 11 klaasist või plastikust (näiteks polüstüreenist, polüpropüleenist, lateksist) helmeid. Lisateabe saamiseks vaadake USA patente nr , nr , nr , nr , nr , nr ja nr Oligonukleotiid tähistab polünukleotiidi, mis koosneb näiteks umbes nt (nukleotiidist) kuni umbes 00 nt. Käesolevas leiutises kasutatavad oligonukleotiidid koosnevad eelistatult umbes nt kuni umbes 0 nt. Oligonukleotiidiks võib olla looduslikult esinev oligonukleotiid või sünteetiline oligonukleotiid. Oligonukleotiidid võivad olla modifitseeritud. Minirakuks" on bakterirakkude tuumadeta vormid, mis on tekkinud koordinatsiooni häirete tõttu DNA segregatsiooniga rakkude jagunemisel esineva binaarse tuuma jagunemise käigus. Minirakud erinevad muudest väikestest vesiikulitest selle alusel, et neid luuakse ja vabastatakse teatud situatsioonides spontaalselt ning need ei ole tingitud spetsiifilistest geneetilistest ümberkorraldustest või episomaalse geeni ekspressioonist. Käesoleva patendi kontekstis on minirakud terviklikud, kuna muud eemaldatud tuumaga vormid nagu sferoplastid, poroplastid ja protoplastid vabastaksid liidetud funktsionaalse nukleiinhappe ja ei oleks seega terapeutiliselt efektiivsed. Terviklike minirakkude membraan võimaldab liidetud materjali hoidmist minirakus ja intratsellulaarset vabastamist märklauaks olevas imetajarakus. Modifitseeritud ja keemiliselt modifitseeritud tähistavad oligonukleotiide või polünukleotiide, mis sisaldavad kõikide või mõne aluse, suhkrufragmendi või internukleosiidi fosfaatühenduse loomulike molekulaarsete struktuuride, nagu ka molekulide, mille vastavatesse piirkondadesse on lisatud asendused või modifikatsioonide kombinatsioon, molekulaarsel tasandil ühte või mitut keemilist modifikatsiooni. Internukleosiidi fosfaatahelduseks võib olla fosfodiester, fosfotriester, fosforamidaat, siloksaan, karbonaat, karboksümetüülester, atseetamidaat, karbamaat, tioeeter, sillatud fosforamidaat, sillatud metüleenfosfonaat, fosforotioaat, metüülfosfonaat, fosforoditioaat, sillatud fosforotioaat või internukleotiidi sulfoonaheldused või 3-3, -3 või - ühendused või selliste ühenduste kombinatsioonid. Fosfodiestri ühenduse võib asendada asendusühenduse nagu fosforotioaadi, metüülamino, metüülfosfonaadi, fosforamidaadi ja guanidiiniga ning polünukleotiidide riboosi allüksus võib olla

13 12 samuti asendatud (näiteks heksoosi fosfodiester või peptiidi nukleiinhapped). Modifikatsioonid võivad olla molekulisisesed (üksikud või korduvad) või asuda oligonukleotiidmolekuli otsas (otstes) ning sisaldada molekulidele internukleosiidi fosfaatühendusi, näiteks deoksüriboosi ja fosfaadi modifikatsioone, mis lõhustavad või ristseonduvad vastastikkuste ahelate või seostuvate ensüümide või muude valkudega. Mõisted modifitseeritud oligonukleotiidid ja modifitseeritud polünukleotiidid hõlmavad samuti vastavalt oligonukleotiide või polünukleotiide, mis sisaldavad suhkrufragmentide modifikatsioone (näiteks 3 -asendatud ribonukleotiidid või deoksüribonukleotiidi monomeerid), mis võivad olla liidetud üksteisega läbi 3 ahelduste. Fraas nukleiinhappe molekulid ja mõiste polünukleotiidid tähistavad mistahes pikkusega nukleotiidide (ribonukleotiidide või deoksünukleotiidide) polümeerseid vorme. Näideteks on ühe-, kahe- või mitmeahelaline DNA või RNA, genoomne DNA, cdna, DNA-RNA hübriidid või puriini või pürimidiini aluseid või muid loomulikke, keemiliselt või biokeemiliselt modifitseeritud, sünteetilisi või deriveeritud nukleotiidi aluseid sisaldav polümeer. Polünukleotiidi tüviahel võib sisaldada suhkru- ja fosfaatrühmasid (mis tavaliselt RNA-s või DNA-s leiduvad) või modifitseeritud või asendatud suhkru- või fosfaatrühmasid. Alternatiivina võib polünukleotiidi tüviahel sisaldada sünteetilistest allüksustest nagu fosforamidiitidest koosnevat polümeeri ning olla seega oligodeoksünukleosiidi fosforamidaat või segunenud fosforamidaadi-fosfodiestri oligomeer. Polünukleotiid võib sisaldada modifitseeritud nukleotiide nagu metüülitud nukleotiide ja nukleotiidi analooge, uratsüüli, muid suhkruid, aheldusrühmasid nagu fluororiboosi ja tioaati ning nukleotiidi harusid. Polünukleotiid saab täiendavalt modifitseerida, näiteks läbi märgistava ühendiga konjugeerimise. Muudeks modifikatsioonide tüüpideks on cap-piirkonnad, ühe või mitme loomulikult esineva nukleotiidi asendamine analoogse nukleotiidiga ja polünukleotiidi valkude, metalliioonide, märgiste, muude polünukleotiidide või tahke toe külge kinnitamise vahendite lisamine. Farmatseutiliselt sobiv tähistab füsioloogiliselt sobivat. Farmatseutiliselt sobiv tugiaine või ekstsipient ei kõrvalda manustatava ravimkoostise bioloogilist aktiivsust, on keemiliselt inertne ning ei ole manustatavale organismile toksiline.

14 13 Näitaja plasmiidivaba tähistab funktsionaalse nukleiinhappe in situ ekspressiooniks vajaliku konstruktsiooni nagu plasmiidi või viirusvektori puudumist. Mõisteid polüpeptiid ja valk kasutatakse käesolevas patendis samatähenduslikult ning need mõisted tähistavad mistahes pikkusega aminohapete polümeerset vormi - hõlmatud on nii transleeritud, transleerimata, keemiliselt modifitseeritud, biokeemiliselt modifitseeritud ja deriveeritud aminohapped. Polüpeptiid või valk võib olla looduslikult esinev, rekombinantne või sünteetiline või nende mistahes kombinatsioon. Lisaks võib polüpeptiid või valk sisaldada looduslikult esineva valgu või peptiidi fragmenti. Polüpeptiidiks või valguks võib olla üksik molekul või mitmest molekulist koosnev kompleks. Lisaks võivad sellised polüpeptiidid või valgud omada modifitseeritud peptiidi tüviahelaid. Nende mõistetega on hõlmatud ka fusioonvalgud, k.a fusioonvalgud heteroloogse aminohappejärjestusega, fusioonid heteroloogsete ja homoloogsete liiderjärjestustega, koos või ilma N-otsa metioniinjääkideta, immunoloogiliselt märgistatud valgud jne. Puhastatud tähistab ühendit, mis on eemaldatud selle loomulikust keskkonnast ja on vähemalt umbes 60%, 6%, 70%, 7%, 80%, 8%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 9%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9%, või 99,99% ulatuses puhas muudest ühenditest, millega see loomulikus olekus koos on. Reguleeriv RNA" tähistab RNA-de kategooriat, mis mõjutavad läbi RNA inferferentsi, geeni ekspressiooni mahasurumise või mõne muu mehhanismi ekspressiooni. Reguleerivateks RNA-deks on lisaks shrna-le, sirna-le, mirnale ja antisense-ssrna-le ka ribosüümid ja peibutis-rna-d. Ribosüümideks on RNA molekulid, mille ensümaatiline aktiivsus võimaldab korduvat lõhustamist muudest RNA molekulidest nukleotiidi alusjärjestuse spetsiifilisel viisil. RNA interferents (RNAi) tähistab eespool kirjeldatud RNA juhitava t mehhanismi, mis hõlmab komplementaarse või osaliselt komplementaarse märklauaks oleva

15 14 RNA lagundamist järjestuse või geeni spetsiifiliseks geeni ekspressiooni reguleerimiseks (valgu sünteesiks). Järjestuse identsus tähendab sarnasuse või komplementaarsuse astet. Esineda võib osaline identsus või täielik identsus. Osaliselt komplementaarseks järjestuseks on järjestus, mis inhibeerib vähemalt osaliselt identse järjestuse hübridiseerumist märklaudpolünukleotiidiga; see on tähistatud funktsionaalse mõistega "põhimõtteliselt identne". Täielikult komplementaarse järjestuse hübridisatsiooni inhibeerimist märklaudjärjestusega saab uurida hübridisatsioonianalüüsiga (Southern või Northern blot, lahuse hübridisatsioon jne) madala rangusega tingimustes. Põhimõtteliselt identne järjestus või sond konkureerib ja inhibeerib madala rangusega tingimustes täielikult identse järjestuse või sondi seondumist (s.t hübridisatsiooni) märklaudjärjestusega. See ei tähenda, et madala rangusega tingimused võimaldavad mittespetsiifilise seondumise toimumist; madala rangusega tingimused nõuavad, et kahe järjestuse üksteisega seondumine oleks spetsiifiline (s.t selektiivne) interaktsioon. Mittespetsiifilise seondumise puudumist saab analüüsida teise märklaudjärjestuse kasutamisega, millel puudub isegi osaline komplementaarsuse aste (näiteks vähem kui umbes % identsus); mittespetsiifilise seondumise puudumisel ei hübridiseeru sond teise mittekomplementaarse märklaudjärjestusega. Veel üks moodus järjestuse identsuse vaatlemiseks kahe nukleiinhappe või polüpeptiidjärjestuse kontekstis nõuab, et kahe järjestuse viitejäägid oleksid mingi kindla piirkonna maksimaalse vastavuse saavutamiseks reastatuna samad. Siin kasutatuna tähistab järjestuse identsuse protsent väärtust, mis määratakse kahe optimaalselt kõrvutatud järjestuse võrdlemisega võrdlusakna ulatuses ning võrdlusaknas asuv polünukleotiidjärjestuse osa võib sisaldada kahe järjestuse optimaalseks kõrvutamiseks võrreldes viitejärjestusega lisamisi või deletsioone (s.t tühimikke) (viite järjestus lisamisi ja deletsioone ei sisalda). Protsent arvutatakse, määrates positsioonide arvu, kus mõlemas järjestuses esineb identne nukleiinhappe alus, saades seeläbi ühilduvate positsioonide arvu, mis jagatakse seejärel võrdlusakna kogu positsioonide arvuga ning saadud tulemus korrutatakse järjestuse identsuse protsendi saamiseks 0-ga.

16 Lühike interfeeruv RNA (sirna) tähistab üldiselt umbes kuni umbes nukleotiidi pikkuseid kaheahelalisi RNA molekule, mis on võimelised RNA interferentsi (RNAi) vahendama. sirna molekulid on üldiselt võimelised valgu ekspressiooni vähendamiseks läbi otsese interaktsiooni valku kodeeriva transkriptiga. Funktsionaalse nukleiinhappe terapeutiliselt efektiivseks koguseks on kõnealuse molekuli nagu sirna, mirna või vaba shrna annus, mis tekitab patsiendile manustatuna käesolevale leiutisele vastava farmakoloogilise reaktsiooni. Käesoleva leiutise kontekstis võib terapeutiliselt efektiivne kogus tähistada näiteks haiguse või seisundiga seostuva negatiivse toime või sümptomi ennetamist või leevendamist loommudelis või inimpatsiendis funktsionaalset nukleiinhapet sisaldavate minirakkude manustamisega vastavalt allpool kirjeldatule. Konkreetsel juhul antud patsiendil "terapeutiliselt efektiivseks koguseks" osutuv kogus ei pruugi omada efektiivsust 0% katsealustest, keda on sama haiguse või seisundi jaoks analoogselt ravitud ja seda isegi juhul, kui sellist annust loetakse kogenud praktiseerijate poolt terapeutiliselt efektiivseks annuseks. Sobiv annuse suurus varieerub selles suhtes samuti kui ravitava haiguse või seisundi tüübi, etapi või raskuse funktsioon. Kõikidel juhtudel on käesolevas patendis avaldatud in vitro testimise (näide 2) ja in vivo testimise (näited 4, ja 6) kirjeldus, nagu ka meetodid funktsionaalse nukleiinhappe molekuli minirakkudega manustatud koguse määramiseks (näited 3), mis on üldkirjelduse valguses mõeldud ravimikandidaatide prekliniinilise ja kliinilise testimise teadmisi omavale isikule funktsionaalse nukleiinhappe terapeutiliselt efektiivse koguse määramiseks konkreetse näidustuse vastu rutiinset eksperimenteerimist kasutades. Mõisted ravimine ja ravi ja sarnased on siin kasutatuna mõeldud tähistama üldiselt soovitud farmakoloogilise ja/või füsioloogilise toime saavutamist. Mõju võib olla profülaktiline, avaldudes läbi haiguse või selle sümptomi täieliku või osalise ennetamise, ja/või terapeutiline, avaldudes läbi haiguse ja/või haigusele omistatavate kahjulike kõrvaltoimete osalise või täieliku stabiliseerimise või ravimise. Ravi hõlmab haiguse igasugust ravi imetajal ja eelistatult inimesel, näiteks: (a) haiguse või sümptomi esinemise ennetamist patsiendil, kes võib olla eelnevalt haiguse või sümptomi suhtes vastuvõtlikuks muutunud, kuid kellel ei ole

17 16 haigust või sümptomit veel diagnoositud; (b) haiguse sümptomi aeglustamist, s.t haiguse sümptomi progresseerumise peatamist; või (c) haiguse sümptomi leevendamist, s.t haiguse ja/või selle sümptomite taandumise esilekutsumist. Minirakud Käesoleva leiutise minirakkudeks on E. coli või muude bakterirakkude tuumadeta vormid, mis on tekkinud koordinatsiooni häirete tõttu koos DNA segregatsiooniga esineva rakkude jagunemise binaarse tuuma jagunemise käigus. Prokarüootide kromosoomide replikatsioon on seotud tavapärase binaarse pooldumisega, mis hõlmab membraani moodustumist raku keskele. Näiteks E. coli rakkudes võib min geenide nagu mincd mutatsioon eemaldada membraani moodustumise inhibeerimise rakupoolustel rakkude jagunemise käigus, põhjustades tavapärase tütarraku ning tuumata miniraku moodustumise. Vaadake de Boer et al., 1992; Raskin & de Boer, 1999; Hu & Lutkenhaus, 1999; Harry, 01. Minirakud erinevad muudest väikestest vesiikulitest, mis luuakse ja vabastatakse teatud olukordades spontaanselt ning ei tulene erinevalt minirakkudest spetsiifilistest geneetilistest ümberkorraldustest või episoomi geeni ekspressioonist. Ühes eelistatud teostuses omavad minirakud terviklikke rakuseinasid ( terviklikud minirakud ). Lisaks min operoni mutatsioonidele saab tuumadeta minirakud valmistada samuti muude geneetiliste ümberpaigutuste või mutatsioonidega, mis mõjutavad vaheseina moodustumist, näiteks divicb1 B. subtilise rakkudes. Vaadake Reeve ja Cornett, 197. Minirakud saab moodustada ka läbi rakkude jagunemises/kromosoomi segregatsioonis osalevate proteiinide geeniekspressiooni tasemete häirimise. Näiteks mine liigne ekspressioon põhjustab polaarset jagunemist ja minirakkude teket. Kromosoomi segregatsiooni defektid võivad anda ka väiksema kromosoomide arvuga minirakke, näiteks smc mutatsioon Bacillus subtilises (Britton et al., 1998), spooj deletsioon B. subtilises (Ireton et al., 1994), mukb mutatsioon E. colis (Hiraga et al., 1989) ja parc mutatsioon E. colis (Stewart ja D Ari, 1992). Geeniproduktid võivad olla ka trans. Suure koopiate arvuga plasmiidist toimuva liigse ekspressiooni korral võib näiteks CafA suurendada rakkude jagunemise kiirust ja/või inhibeerida kromosoomide jaotumist pärast replikatsiooni (Okada et al., 1994), põhjustades aheldatud

18 17 rakkude ja tuumata minirakkude moodustumise (Wac hi et al., 1989). Minirakud saab valmistada igast gram-positiivse või gram-negatiivse päritoluga bakterirakust. Ühes teostuses võivad minirakud sisaldada ühte või mitut plasmiidivaba funktsionaalset nukleiinhapet, mille transport rakkudesse soovitav on. Käesoleva leiutise funktsionaalsed nukleiinhapped on võimelised valgu ekspressiooni vähendamiseks läbi otsese interaktsiooni valku kodeeriva transkriptiga. Funktsionaalsete nukleiinhapete viimine terviklikesse minirakkudesse Funktsionaalse nukleiinhappe võib viia otse terviklikesse minirakkudesse. Selle protsessiga välditakse eelnevalt vaja läinud etappe, mis puudutasid näiteks funktsionaalset nukleiinhapet kodeerivate nukleiinhapete kloonimist ekspressiooniplasmiididesse, minirakke tootvate lähtebakterite transformeerimist plasmiididega ja rekombinantsete minirakkude loomist. Selle asemel saab plasmiidivaba funktsionaalse nukleiinhappe viia läbi terviklike minirakkude hulga inkubeerimise puhvris koos funktsionaalse nukleiinhappega otse terviklikesse minirakkudesse. Mõningates käesoleva leiutise teostustes võib koos inkubeerimisega kaasneda ka õrn segamine, samas kui muudes teostustes on koos inkubeerimine staatiline. Tavaliselt piisab umbes 1 tunni pikkusest koos inkubeerimise perioodist, kuid efektiivseks võivad osutuda ka lühemad perioodid, näiteks pool tundi. Ühes käesoleva leiutise teostuses on puhvriks puhverdatud soolalahus, näiteks 1X fosfaatpuhvri lahus. Puhverdatud soolalahus võib olla geeli vormis. Veel ühes käesoleva leiutise teostuses toimub koos inkubeerimine temperatuurivahemikus umbes 4 C kuni umbes 37 C, umbes C kuni umbes C, umbes C või umbes 37 C. Muudes käesoleva leiutise teostustes võib koos inkubeerimiseks kasutada umbes 7, 8, 9,, 11, 12 või 13 minirakku. Kindlate tingimuste kombinatsioonide jaoks võib kõne alla tulla ka temperatuuri, aja, puhvri, minirakkude kontsentratsiooni jne optimeerimine. Selle meetodi edukus on üllatav, kuna viimase neljakümne aasta jooksul on teadlased töötanud välja mitmeid erinevaid keemilisi ja elektrokeemilisi protsesse (ülevaate avaldanud Miller, 1994) nukleiinhapete transformeerimiseks bakterirakkudesse. Teadlased on kasutanud selliseid karme meetmeid, kuna teaduses valitsevate tavaarusaamade põhjal on nukleiinhapped nagu sirna,

19 18 mirna või plasmiidivaba shrna minirakkude tsütoplasmasse passiivseks sisestamiseks liiga suured. β-trumli proteiinideks olevad poriinid, mis omavad tavaliselt funktsiooni difusiooni pooridena, võimaldavad molekulide, mille molekulmassiks on 600 daltonit või vähem, passiivset transporti läbi bakteri välismembraani (Nikaido, 1994). Samas shrna -d kodeeriva kaheahelalise plasmiidi DNA suuruseks on rohkem kui miljon daltonit ja kaheahelalise sirna või mirna suurus ületab 000 daltonit. Lisaks jääb funktsionaalne nukleiinhape pärast minirakku viimist minirakku ning on kaitstud lagunemise eest. sirna-d sisaldavate minirakkude pikendatud inkubeerimisuuringud steriilses soolalahuses ei näidanud sirna-de lekkimist. Lisaks kinnitas sirna-d sisaldavate minirakkude inkubeerimine koos nukleaasidega, et sirna-d olid tunginud läbi terviklike minirakkude välismembraani ning olid lagunemise eest kaitstud. Hoolimata faktist, et minirakud eeldatakse sisaldavat lähtebakteri tsütoplasmast pärinevaid jäägi nukleaase, on minirakku viidud sirna miniraku tsütoplasmas stabiilne. Minirakku viidud sirna väldib samuti fagolüsosoomides nagu hapetes, vabades hapniku radikaalides ja happe hüdrolaasides leiduvat lagundavat mehhanismi (Conner ja Schmid, 03), mis mõjutab märklaud-mrna knock-downi imetajarakkudes. Muudes teostustes võib samasse minirakku viia mitu funktsionaalset nukleiinhapet, mis on suunatud erinevatele mrna märklaudadele. Sellist meetodit saab kasutada ravimiresistentsuse ja apoptoosiresistentsuse vastu võitlemiseks. Näiteks kasvajaga patsientidel esineb väga sageli resistentsus kemoterapeutiliste ravimite vastu. Selline resistentsus võib olla vahendatud geenide nagu muuhulgas ka mitme ravimi resistentsuse (MDR) pumpade ja antiapoptootiliste geenide liigse ekspressiooni poolt. Selle resistentsuse vastu võitlemiseks saab minirakud täita MDR-seostuvate geenide funktsionaalsete nukleiinhapete terapeutiliselt oluliste kontsentratsioonidega ning manustada enne kemoteraapia algust patsiendile. Lisaks võib mitme funktsionaalse nukleiinhappe, mis on suunatud erinevate mrna märklaudade vastu, viimine samasse minirakku suurendada terapeutilist efektiivsust, kuna enamus molekulaarseid märklaudasid alluvad mutatsioonidele ning omavad mitmeid alleele.

20 19 Seega võimaldab plasmiidivabade funktsionaalsete nukleiinhapete viimine siin kirjeldatud meetodeid kasutades otse terviklikesse minirakkudesse mitmeid eeliseid. Kuna käesoleva patendi meetod ei vaja lähtebakterite geneetilist muundamist funktsionaalse nukleiinhappe ekspressiooni sisaldamiseks, saab paljusid nukleiinhappe tüüpe, mis on suunatud erinevate haiguste vastu, sisaldavate minirakkude tootmiseks kasutada ühte lähtebakterit. Miniraku saab täita ka erinevate RNA-dega, vältides või ületades seeläbi resistentsusmehhanismid. Funktsionaalsed nukleiinhapped Nagu eespool mainitud, tähistab funktsionaalne nukleiinhape nukleiinhappe molekulide kategooriat, mis mõjutavad ekspressiooni läbi RNA inferferentsi, geeni ekspressiooni mahasurumise või mõne muu mehhanismi. Selliste molekulide näideteks on ühe-, kahe- või mitmeahelaline DNA või RNA. Funktsionaalsete nukleiinhapete näideteks on reguleeriv RNA, näiteks shrna, sirna, mirna ja antisense-ssrna ning seega ribosüümid ja peibutis-rna-d ja antisensenukleiinhapped. Ühes käesoleva patendi eelistatud teostuses sisaldavad terviklikud minirakud sirna molekule. Lühikesed interfeeruvad RNA molekulid on kasulikud RNAi sooritamiseks, mille näol on tegemist transkriptsioonijärgse geenivaigistusmehhanismiga. Nagu eespool mainitud, tähistab sirna üldiselt umbes kuni umbes nukleotiidi pikkuseid kaheahelalisi RNA molekule, mis on nimetatud nende võime alusel proteiini ekspressiooniga spetsiifiliselt interfeeruda. Eelistatult on sirna molekulide pikkuseks nukleotiidi, eelistatumalt - nukleotiidi, veelgi eelistatumalt nukleotiidi ja kõige eelistatumalt nukleotiidi. Seega on eelistatud sirna molekulid 12, 13, 14,, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24,, 26, 27, 28 või 29 nukleotiidi pikkused. Ühe ahela pikkus tähistab sirna molekuli pikkust. Näiteks sirna, mida on kirjeldatud kui 21 ribonukleotiidi pikkust (21 -meeri), võib koosneda kahest vastastikkusest RNA ahelast, mis on anniilitud kokku 19 katkematuks aluspaariks. Kummagi ahela kaks alles jäänud ribonukleotiidi oleksid "eendiks. Kui sirna sisaldab kahte erineva pikkusega ahelat, määrab sirna pikkuse pikem ahel.

21 Näiteks dsrna-d, mis sisaldab ühte 21 nukleotiidi pikkust ahelat ja ühte nukleotiidi pikkust ahelat, loetakse 21-meeriks. Eelistatud on eendiga sirna-d. Eend võib asuda ahela või 3 otsas. Eelistatult asub eend RNA ahela 3 otsas. Eendi pikkus võib varieeruda, kuid eelistatult koosneb eend umbes 1 kuni umbes alusest ja kõige eelistatumalt umbes 2 nukleotiidist. Eelistatult sisaldavad käesoleva leiutise sirna-d 3 otsas umbes 2 kuni 4 aluse pikkust eendit. Eelistatumalt on 3 otsa eendi pikkuseks 2 ribonukleotiidi. Veelgi eelistatumalt on kaks 3 otsa eendi moodustavad ribonukleotiidi uridiinid (U). shrna-d koosnevad üheahelalisest RNA-st, mis moodustab tüvi-ja-ling-struktuuri, kus tüvi koosneb komplementaarsetest sense- ja antisense-ahelatest, mis sisaldavad kaheahelalist RNA-d, ning ling on erineva suurusega linker. shrna-de tüve-struktuuri pikkuseks on tavaliselt umbes kuni umbes nukleotiidi. Eelistatult on shrna molekulide tüve-struktuuri pikkuseks nukleotiidi, eelistatumalt - nukleotiidi, veelgi eelistatumalt nukleotiidi ja kõige eelistatumalt nukleotiidi. Seega sisaldavad eelistatud shrna molekulid 12, 13, 14,, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24,, 26, 27, 28 või 29 nukleotiidi pikkuseid tüve-piirkondi. Käesoleva leiutise sirna-d on mõeldud interaktsiooniks märklauast ribonukleotiidjärjestusega, mis tähendab, et need täiendavad märklaudjärjestust piisavalt märklaudjärjestuse hübridiseerimiseks. Ühes käesoleva leiutise teostuses on avaldatud sirna molekul, milles sisalduv ribonukleotiidjärjestus on vähemalt 70%, 7%, 80%, 8% või 90% ulatuses identne märklauast ribonukleotiidjärjestuse või märklauast ribonukleotiidjärjestuse komplemendiga. Eelistatult on sirna molekul vähemalt 90%, 9%, 96%, 97%, 98%, 99% või 0% ulatuses märklauast ribonukleotiidjärjestuse või märklauast ribonukleotiidjärjestuse komplemendiga identne. Kõige eelistatumalt on sirna märklauast nukleotiidjärjestuse või ribonukleotiidjärjestuse komplemendiga 0% ulatuses identne. Kuid efektiivseks võivad osutuda ka sirna molekulid, mis omavad võrreldes märklaudjärjestusega insertsioone, deletsioone ja üksikuid punktmutatsioone.

22 21 Seega ühes käesoleva leiutise teostuses võivad terviklikud minirakud sisaldada ühte või mitut sirna järjestust, mis omakorda on mõeldud ravimiresistentsust või apoptoosiresistentsust põhjustavate geenide vaigistamisele. Mitut sirna-d kodeerivaid minirakke kasutades on võimalik ravida rakke, mis omavad resistentsust mitme ravimi suhtes. sirna-de ja reguleeriva RNA ehituse hindamiseks mõeldud vahendid on avalikkusele kättesaadavad. Näiteks arvutipõhine sirna loomise vahend on saadaval Internetist aadressilt Funktsionaalse nukleiinhappe märklauad Käesoleva leiutise funktsionaalne nukleiinhape on suunatud eelistatult proteiini, mis soodustab ravimiresistentsust, inhibeerib apoptoosi, soodustab neoplastilist fenotüüpi, inhibeerib patogeenide proliferatsiooni või inhibeeriv viiruse replikatsiooni või proliferatsiooni, geenile või transkriptile. Varasemast teada mitmed selles kontekstis toimunud funktsionaalse nukleiinhappe strateegiate kasutamised, kuid ilma miniraku vektoriteta. Vaadake näiteks Sioud (04), Caplen (03), Wu et al. (03), Yague et al. (04). Funktsionaalsete nukleiinhapete eelistatud märklaudadeks on ravimiresistentsust tekitavad või neoplastilist fenotüüpi soodustavad valgud. Sellised valgud võivad soodustada omandatud ravimiresistentsust või loomupärast ravimiresistentsust. Resistentsuse fenotüüp omandatakse, kui haigestunud rakud nagu tuumorirakud reageerivad algselt ravimitele, kuid muutuvad järgnevate ravitsüklite käigus ravile allumatuteks. Omandatud või omase ravimiresistentsuses osalevateks kasulikeks märklaudadeks on ATP siduva kasseti transporterid nagu P-glükoproteiin (P-gp, P- 170, PGY1, MDR1, ABCB1, MDR-seostuv proteiin, mitme ravimi vastu resistentne proteiin 1, MDR-2 ja MDR-3, MRP2 (mitme ravimi vastu resistentne proteiin), BCRABL (murdepunkti klasterpiirkond - Abelsoni proto-onkogeen), STI-71 resistentsusega seostuv proteiin, kopsu resistentsusega seostuv proteiin, tsüklooksügenaas-2, tuuma faktor kappa, XRCC1 (röntgen -ristkomplementaarne grupp 1), ERCC1 (ergastuse ristkomplementaarne geen), GSTP1 (glutatiooni S - transferaas), mutant β-tubuliin, Abcb1a (ABCB4), Abcc1, Abcc2, Abcc3 (MLP -2), Abcc, Abcc6, Abcd2, Abcg2, Bax, Bcl2, Bcl21 (bcl -x), Mvp, Rb1, Top1, Top2a,

23 22 Top2b ja Trp3 (p3). Muudeks ravimiresistentsuses osalevateks geenideks on samuti (a) ravimi metabo lismis osalevad geenid, näiteks Arnt, Blmh, C102I12Rik (CRR9p), Comt, Crabp1, Cyp1a1, Cyp1a2, Cyp2b19, Cyp2b, Cyp2c29, Cyp2c40, Cyp2c70, Cyp2d22, Cyp2e1, Dhfr, Ephx1, Ephx2, Gstm1 (MGST1), Gstp1, Nat2, Nqo1, Sod1, Ste, Tpmt, Tyms ja Ugcg; (b) DNA parandamises osalevad geenid, näiteks Apc, Atm, Brca1, Brca2, Ercc3 (XPB), Mgmt, Mlh1, Xpa, Xpc, (c) rakutsüklis osalevad geenid, näiteks Ccnd1 (tsükliin D1), Ccne1 (tsükliin E1), Cdk1, Cdk2, Cdk4, Cdkn1a (p2iwaf1), Cdkn1b (p27kip1), Cdkn2a (p16ink4a), Cdkn2d (p19) ja KSP; (d) kasvufaktori retseptorites asuvad geenid nagu Egfr, Erbb2 (Neu, HER2), Erbb3, Erbb4, Fgf2 (bfgf) ja Met, (e) hormooni retseptorites asuvad geenid nagu Ar, Esr1, Esr2, Igf2r, Ppara, Ppard, Pparg, Ppargc1, Rara, Rarb, Rxra, Rxrb, Rxrg ja Srda2; ning (f) transkriptsioonifaktorite geenid, näiteks Ahr, Ap1s1, Ap1s2, Elk1, Fos (c -fos), Gabpa, Hif1a, Mafb, Myc (c -myc), Nfkb1, Nfkb2, Nfkbib, Nfkbie, Relb (1 -rel) ja Tnfrsf11A. Kasulikeks märklaudadeks on ka apoptoosiresistentsust soodustavad valgud. Selliste valkude näideteks on Bcl-2 (B-raku leukeemia/lümfoom), Bcl-XL, A1/Bfl 1, fokaalne adhesiooni kinaas ja p3 mutantvalk. Kasulikeks märklaudadeks on ka onkogeensed ja muteerunud tuumori supressorproteiinid. Selliste valkude näideteks on β-kateniin, PKC-α (valgukinaas C), C-RAF, K-Ras (V12), h -Ras, DP97 surnud järjestuse ( Dead box) RNA helikaas, DNMT1 (DNA metüültransferaas 1), FLIP (Flice-sarnane inhibeeriv valk), C-Sfc, 3BPI, Polycomb grupi valk EZH2 (Zeste homoloogi võimendaja), ErbB 1, HPV-16 E ja E7 (inimese varajane papilloomviirus ja 7), fortiliin ja MCI1P (müeloidrakulise leukeemia 1 proteiin), DIP13α (DDC interaktsioonivalk 13a), MBD2 (metüüli CpG siduv domään), p21, KLF4 (Kruppeli -sarnane faktor 4), tpt/tctp (translatsiooniliselt kontr ollitud tuumorivalk), SPK1 & SPK2 (sfingosiini kinaas), P0, PLK1 (Polo -sarnane kinaas-1), Trp3, Ras, ErbB1, VEGF (veresoonte endoteeli kasvufaktor) ja BAG-1 (BCL2-seostuv atanogeen 1). Kasvaja ravimiseks on leitud suur hulk molekulaarseid märklaudasid ja RNAi avastusplatvormid on leidnud kiiresti suure hulga uusi erinevaid märklaudasid. Käesoleva leiutise eesmärkidel kasulikuks osutuvate selliste molekulaarsete

24 23 märklaudade näideteks on türosiini kinaas (variant), Akt (proteiinkinaas B, PKB), Akt1, alfa-l-beeta2 integriin, aminopeptidaas, androgeeni retseptor, Aurora A, AuroraB, aluselise fibroblasti kasvufaktori (bfgf) retseptor (bfgfr), BRaf, kartsinoembrüoonne antigeen (CEA), CD142, CD37, CD44, CD, CD74, CD77, Chk1, CHK2, CHras, CSF1r, CXCR4, tsükliin D1 (CCND1), tsükliinsõltuv kinaas 1 (CDK1), tsükliinsõltuv kinaas 2 (CDK2), tsükliinsõltuva kinaasi inhibiitor 1B (CDKN1B, p27, KIP1), CYP26, fibroblasti kasvufaktori retseptor 3 (FGFr3), fibroblasti kasvufaktori retseptor 4 (FGFr4), G0, Hedgehog (Hh) signalisatsioonirada, hepatotsüüdi kasvufaktor/hajumisfaktor (HGF/SF või SF/HGF), HEr4 (ErbB4), HIF, histooni deatsetülaas 9 (HDAC9), homöojärjestuse geen (HOXB7), hüaluronaan (HA), insuliinisarnane kasvufaktor (IGF), insuliinisarnase kasvufaktori 1 retseptor (IGF1r, IGF1r, IGFIr, IGFIr), insuliinisarnast kasvufaktorit siduv proteiin 2 (IGFBP2), insuliinisarnast kasvufaktorit siduv proteiin (IGFBP), integriinisarnane kinaas (ILK), interleukiini (IL6) retseptor, interleukiini 1 (IL1) retseptori tüüp II, int erleukiin (IL), interleukiin 4 (IL4) retseptor, interleukiin 6 (IL6), interleukiin (IL), interleukiin 3 retseptor alfa (IL3r alfa) ahel, JAK, JAK3, JNK1, JNK2, kinesiini käävivalk (KSP), laminiin, Lewis (b), lümfotoksiin (LT) beeta retseptor (L TBr), lüsofosfatiidhappe (LPA) retseptorid (LPAr), lüsofosfatiidhappe atsüültransferaas, makrofaagi migratsiooni inhibeeriv faktor (MIF), MAGE3, mikrotuubulid, MUC2, Notch 1 (TAN1), P38 mitogeeni aktiveeritud proteiinkinaas (p38 MAPK), P3 ülereguleeritud apoptoosi vahendaja (PUMA), PDGF türosiinkinaasi (TK) signalisatsioonirada, fosfataasi ja tensiini homoloog (PTEN), fosfatidüülinositooli 3 kinaas (PI3K), plasminogeeni aktivaator, urokinaasi (PLAU) retseptor (PLAUr), Polo-sarnane kinaas 1 (Plk1), Polü (A DP riboos), polümeraas (PARP), proliferatiivsete rakkude tuuma antigeen (PCNA), eesnäärme tüvirakkude antigeen (PSCA), eesnäärme spetsiifiline antigeen (PSA) 773, proteiin -türosiini fosfataas (PTP), Rad1 proteiin, RAF1, retinoehappe retseptor (RAr) alfa, retinoehappe retseptor (RAr) gamma, retinoidi X retseptor (RXr) beeta, seriini (või tsüsteiini) proteinaasi inhibiitor, telomeraasi pöördtranskriptaas (TERT, htert), telomeerid, Thomsen-Friedenreichi (TF) antigeen, trombospondiin 1 (TSP1), transferriin, tuumori nekroosifaktor alfa (TNFa, TNFA), tuumori nekroosifaktori retseptor (TNFr, TNFr), tuumoriga seostuv süsinikanhüdraas (CA) IX (CA9), I tüübi interferoon,