BIOKOMPATIBILNOST NOSILCEV ZA GOJENJE UMETNIH TKIV

Transcription

1 UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA NARAVOSLOVJE IN MATEMATIKO ODDELEK ZA FIZIKO Program: Predmet: Nosilec: Fizika, III. stopnja Biofizika II prof. dr. Milan Brumen BIOKOMPATIBILNOST NOSILCEV ZA GOJENJE UMETNIH TKIV Avtor: Mentor: Seminar Iztok Urbančič* doc. dr. Janez Štrancar Povzetek: V laboratoriju vzgojena tkiva bi lahko močno olajšala življenja mnogih bolnikov s poškodovanimi ali okvarjenimi organi. V ta namen obnovitvena medicina pospešeno razvija nosilce, ki celicam omogočajo naravnemu enakovredno okolje za rast in razvoj. Zaradi zapletenosti množice interakcij med celicami in naravnim ogrodjem je biokompatibilnost uporabljenega materiala še vedno velik izziv. V seminarju podajam pregled današnjega poznavanja osnovnih biofizikalnih in biokemijskih interakcij celic z okoljem in predstavljam koncepte, ki usmerjajo razvoj nosilcev za gojenje umetnih tkiv. Na koncu predlagam nekaj poskusov, ki bi lahko doosvetlili razumevanje posameznih koščkov osupljivega mozaika narave. Ključne besede: biokompatibilnost, umetna tkiva, trorazsežni nosilci, gojenje celic, zunajcelični matriks, interakcije Ljubljana, 2010 * Inštitut»Jožef Stefan«, Odsek za fiziko trdne snovi (F5), Laboratorij za biofiziko Jamova 39, SI-1000 Ljubljana; +386(0) , iztok.urbancic@ijs.si

2 Biokompatibilnost nosilcev za gojenje umetnih tkiv Vsebina 1 Živeti Celice v naravnem okolju Mreža, po kateri»plezajo«celice zunajcelični matriks Pripenjanje celice na ECM integrini Interakcije med celicami in ECM Celice v umetnem okolju Biofizikalni in biokemični vplivi Biomehanski vplivi Vplivi 3D Materiali za nosilce tkiv Naravni biomateriali Umetni biomateriali Razglabljanje Viri Seznam pogosto uporabljenih kratic in oznak ECM GAG R G D zunajcelični matriks (angl. extracellular matrix) glikozaminoglikan aminokislina arginin aminokislina glicin aminokislina aspartat 2

3 1 Živeti Želja po ohranjanju življenja in zdravja je nedvomno eno najnaravnejših vodil našega bivanja. Izražena je že v najstarejših mitih davnih civilizacij, denimo v grški legendi o Prometeju z nenehno obnavljajočimi se jetri ali v pripovedih o svetnikih Kozmi in Damjanu ter njuni čudežni presaditvi noge bolnika. Kar so bile nekoč le sanje, je z napredovanjem medicinskih in bioloških znanj vedno bolj postajalo del stvarnosti. Na egipčanskih mumijah so že našli umetne oči, ušesa, nosove in zobe, Kitajci in Indijci so za telesne nadomestke uporabljali voske, smole in tkanine. 1 Omenjeni posegi so lahko začasno povrnili lepotne lastnosti okvarjenih tkiv, medtem ko povečini niso mogli imeti občutne uporabne vloge. Nadaljnje odkrivanje skrivnosti delovanja narave je omogočalo vedno globlji vpogled v osnovne mehanizme bolezni in poškodb ter posledično njihovo odpravljanje ali vsaj lajšanje posledic. Obnavljanje lastnosti in sposobnosti okvarjenih delov telesa je postalo pomembno področje medicine, katerega prelomen dosežek je bil vsekakor uspešen prenos delujočega organa darovalca bolniku. Danes s presajanjem organov in z vgrajevanjem umetnih protez izboljšujejo in rešujejo življenja mnogih bolnikov. Z ustreznimi predhodnimi testiranji in z naknadnim nadzorom imunskega odziva gostitelja lahko z veliko verjetnostjo zagotovijo, da bo telo sprejelo novi organ in ga vključilo v delovanje organizma. Največja težava metode je pomanjkanje darovanih organov. Samo v Združenih državah Amerike trenutno čaka na presaditev okoli ljudi, 2 mnogi med njimi čakanja ne bodo preživeli. Med izbranci, ki dočakajo presaditev, je vseeno možno, da telo zavrne novi organ, tudi zdravila za dušenje imunskega odziva imajo lahko hude stranske posledice. Omenjene omejitve torej glasno zahtevajo iskanje novih možnosti za pridobivanje prepotrebnih tkiv in organov. Veliko obetajoča rešitev leži v umetnem gojenju bioloških tkiv, ki lahko popolnoma nadomestijo vlogo okvarjenih. Tkivo lahko v laboratoriju vzgojijo na nosilnem ogrodju (angl. scaffold ali matrix) in ga nato presadijo v telo. 2 Pri tem lahko uporabijo zarodne ali že diferencirane celice bolnika ali darovalca. Druga možnost je vsadek samega nosilca na poškodovano mesto, ki nato omogoča zdravim okoliškim celicam, da se razmnožijo, razširijo in diferencirajo v delujoče tkivo. Nosilec lahko ostane trajno prisoten v telesu, še bolj zaželeno pa je, da se postopoma razgradi, ko si celice novega tkiva izdelajo lastno naravno ogrodje. Pri obeh metodah je ključna izbira pravilnega nosilca tkiva; material, njegove mehanske lastnosti ter fizična in kemična obdelava pomembno vplivajo na preživetje in razvoj celic. Za idealno vgrajevanje mora nosilec izpolnjevati kar nekaj pogojev: 3,4 1. celicam mora omogočati oprijemanje, rast, delitev, diferenciacijo in preseljevanje, 2. zagotavljati mora zadostno difuzijo prehranskih in odpadnih snovi; 3

4 Biokompatibilnost nosilcev za gojenje umetnih tkiv 3. celicam mora nuditi zadostno oporo, dokler si ne zgradijo lastne nosilne mreže, 4. nato se mora kontrolirano razgraditi; 5. ob tem ne sme vzbuditi nikakršnega imunskega odziva gostitelja, 6. ravno tako neškodljivi morajo biti tudi njegovi razpadni produkti; 7. izdelava nosilca mora biti dovolj preprosta in prilagodljiva potrebam različnih tkiv. Za snovi, ki izpolnjuje vse pogoje t. i. biokompatibilnosti, se je uveljavil izraz biomateriali. Tako stroge zahteve pred množično klinično uporabo terjajo mnogo poskusov in vitro in in vivo ter poglobljeno razumevanje interakcij med materialom in celicami oz. tkivom. Prvi korak na poti spoznavanja je vsekakor raziskovanje celic v njihovem naravnem okolju. 4

5 2 Celice v naravnem okolju Prostor med večino živalskih celic je prepreden z mrežo sladkorno-proteinskih makromolekul, ki jih izločajo, predelujejo in razkrajajo v njem živeče celice. Ta t.i. zunajcelični matriks (angl. extracellular matrix, ECM) ima za celice, ki jih obdaja, številne življenjsko pomembne vloge. Celicam daje fizično oporo, odločilno vpliva na njihovo rast, razmnoževanje, razvijanje in preseljevanje, preko mreže se celice med seboj tudi sporazumevajo, tkivom daje njihove mehanske lastnosti 2.1 Mreža, po kateri»plezajo«celice zunajcelični matriks Molekule, ki gradijo zunanji skelet, izločajo celice z imenom fibroblasti. V nekaterih vezivnih tkivih zavzema ECM celo več prostora kot celice same. 5 Gradita ga dve družini molekul: proteoglikani tvorijo močno hidrirano gelsko strukturo, v kateri se nahajajo vlaknate beljakovine. Prva komponenta je odgovorna za prenašanje tlačnih sil in uravnava hitrost difuzije snovi, medtem ko je druga odporna na natezne obremenitve, organizira celotno mrežo in tako pomaga celicam pri pritrjevanju, razvijanju in preseljevanju. Proteoglikani in beljakovine, ki gradijo ECM, zanimivo, v nekaterih tkivih predstavljajo le okoli 1 % snovi, ki zapolnjuje prostor med celicami, 6 a vseeno dobro določajo mehanske lastnosti razmeroma čvrste strukture Proteoglikani in glikozaminoglikani vežejo vodo Proteoglikani so proteinske molekule, ki imajo na več mestih na serinske aminokisline pripete dolge nerazvejane polisaharidne verige glikozaminoglikane (GAG). Te so sestavljene iz ponavljajočega se disaharidnega vzorca, v katerem eden od obeh sladkorjev vedno vsebuje aminsko skupino (Slika 1). Zaradi sulfatnih in karboksilnih skupin na sladkornih enotah so GAGi močno negativno nabiti. Tudi zato se tovrstne molekule ne zvijajo v kompaktne kroglaste oblike, ampak prostor le redko premrežijo. Ker so močno polarne, lahko preko številnih vodikovih vezi vežejo mnogo vodnih molekul; negativni naboj na verigah obenem privlači tudi pozitivne ione, kar še poveča osmotski tlak in s tem vdiranje vode. Taki porozni hidrogeli z veliko količino GAGov so zaradi nestisljivosti vode zatorej zelo odporni na tlačne obremenitve, kar narava s pridom izkorišča denimo v hrustančnih oblogah sklepov. 5 Poleg mehanske vloge imajo proteoglikani tudi precej specifičnih vezavnih mest, s katerimi omogočajo interakcije med celicami in ECM. 5

6 Biokompatibilnost nosilcev za gojenje umetnih tkiv a) b) Slika 1: V strukuri glikozaminoglikanov (GAG) se ponavlja disaharidni vzorec. Na sliki sta primera a) heparan sulfat in b) hialuronan Beljakovine organizirajo prostor Med zunajceličnimi vlaknatimi beljakovinami je pri sesalcih najpogostejši kolagen, ki gradi tudi medcelične strukture kosti in kože ter predstavlja okoli 25 % celotne mase proteinov. 5 To so toge verige treh med seboj povezanih tesno zvitih vijačnic (en zavoj tvorijo le tri aminokisline), ki dajejo tkivu potrebno natezno trdnost. V najbolj obremenjenih tkivih, denimo v mišicah in kitah, so vlakna usmerjena po silnicah prevladujočih obremenitev, kar omogoča največji izkoristek materiala in največjo natezno trdnost tkiva. Ta je po preseku primerljiva s sicer trikrat težjim jeklom. 7 V arterijah, pljučih, koži in drugih tkivih, ki se morajo za nemoteno delovanje pogosto raztegovati, je v ta namen prisoten elastin. Elastične lastnosti prispevajo premrežena vlakna, ki se po obremenitvi zaradi hidrofobnosti verig zvijejo nazaj v naključni klobčič. V primerjavi z gumo je enako debelo vlakno elastina kar petkrat bolj raztegljivo. 7 Poleg omenjenih molekul, ki skrbijo predvsem za mehanske lastnosti tkiva, ima v ECM pomembno vlogo tudi fibronektin, ki gosti mnoga specifična vezavna mesta za druge molekule ECM ali celične receptorje. Tako pomaga organizirati zunajcelično mrežo, omogoča, da se celice pripnejo nanjo, in vodi njihovo preseljevanje. Delovanje fibronektina je močno odvisno od natega v okoliškem tkivu, ki vpliva na zvitje proteina in s tem na izpostavljenost njegovih vezavnih mest. 2.2 Pripenjanje celice na ECM integrini Celice se na ECM pripenjajo s prekmembranskimi beljakovinami, med katerimi so najbolj raziskani integrini. Njihova zapletena zgradba omogoča uravnavanje oprijema celice na zunajcelično mrežo preko vezave mnogo različnih ligandov tako na notranji kot na zunanji strani membrane. 8 Pri tem pride do spremembe konformacije molekul integrina in posledično različne vezavne energije. Ta je sicer v običajni konformaciji v primerjavi z drugimi receptorji zelo nizka, kar celica nadomesti z lokalno 10- do 100-krat večjo koncentracijo integrinov v funkcionalnih področjih, t. i. središčnih stikih (angl. focal contact). 5 Na teh mestih se celična membrana približa ECM na okoli 20 nm. 9 6

7 2 Celice v naravnem okolju Znano je, da se mnogi integrini zelo specifično vežejo na točno določena mesta zunajceličnih proteinov, ki vsebujejo ključno zaporedje aminokislin: arginin (Arg, R)-glicin (Gly, G)-aspartat (Asp, D). 10 Gre za močno polarno vezavno mesto, saj sta arginin in aspartat pozitivno oz. negativno nabita. To privlači del integrina, kjer je med anionskimi stranskimi verigami koordiniran magnezijev ion. 8 Pri tem je nadvse pomembno natančno zaporedje aminoksilin; vzorec RDG denimo nima nobenega vezavnega učinka. 9 Poleg tako svojevrstnih vezav se med celico in ECM vzpostavijo tudi precej manj specifične. Na močno negativno nabite GAGe se rada vežejo mesta celičnih beljakovin, kjer je izpostavljenih več pozitivno nabitih (arginin (R) in lizin (Lys, K)) aminokislin, zraven pa so navadno še hidrofobne (alanin (Ala, A), izolevcin (Ile, I), levcin (Leu, L), prolin (Pro, P) in valin (Val, V)). 9 * Tovrstne šibke vezave na središčnih stikih stabilizirajo močne interakcije integrinov. 2.3 Interakcije med celicami in ECM Mnogi poskusi so pokazali, da celicam ECM predstavlja veliko več kot le fizično oporo. Interakcije z mrežo očitno celici posredujejo mnogo informacij, ki odločajo o njenem razvoju. Če denimo otežimo pripenjanje celic z inhibitorjem, ki z integrinom tekmuje za vezavna mesta na ECM, ali dodamo v raztopino peptide z RGD zaporedjem, ki se namesto fibronektina vežejo na celični integrin, pride do nepravilnega razvoja tkiva ali celo njegovega predčasnega odmrtja. 11 Umetno spremenjene interakcije med celicami in ECM vplivajo tako na rast in razmnoževanje celic kot tudi na njihovo diferenciacijo (izražanje genov) in preseljevanje, kar določa lastnosti nastajajočega tkiva. Natančnost interakcij je pomembna tako pri nastajanju novega tkiva oz. organizma kot pri kasnejšem celjenju ran. 11 Shema vseh interakcij če bi bile poznane bi bila nadvse prepletena, saj posamezne molekule prek različnih vezavnih mest običajno sodelujejo z več ligandi. Prav tako se inerakcije s časom spreminjajo, saj celice tekom svojega razvoja z membranskimi ali izločenimi encimi ECM nenehno gradijo, razkrajajo, odcepljajo funkcionalne skupine in izpostavljajo nove Fascinantna ponazoritev kompleksnosti živega sistema je raziskava, pri kateri so umetno ustvarili delujoče biološko srce. 12 Z detergenti so razgradili celice podganjega srca, tako da je od njega ostal le zunajcelični skelet. Vanj so nato nasadili kulturo še nerazvitih srčnih ali endotelijskih celic, ki so se v tednu dni razvile v samostojno bijoče srce. Kdaj si lahko obetamo primerljiv rezultat na povsem umetno pripravljenih nosilcih? * Podobne nescpecifične interakcije so odgovorne tudi za povezave med celicami. 9 Manjša odvisnost od pripenjanja na mrežo oz. večja gibljivost je sicer značinost rakavih celic. 5 7

8 3 Celice v umetnem okolju Iz primerov v prejšnjem poglavju je očitno, da je celično okolje nadvse pomembno za pravilen razvoj celice, tkiva oz. organizma. Pri gojenju umetnih tkiv, kjer se celice znajdejo v tujem okolju umetnega nosilca, je torej potrebno poskrbeti, da nova okolica zadovoljivo oponaša naravno. Pri preizkušanju novega materiala je nujno v laboratoriju (in vitro) temeljito preveriti, kako nosilec omogoča pripenjanje celic na mrežo (merjenje sil je sicer razmeroma težavno, zato so izsledki različnih raziskav precej neprimerljivi; potencialni standardni tehniki bi lahko bili centrifuga ali laminarni tok tekočine), 13 ali spodbuja normalno celično rast in razmnoževanje (opazovanje števila celic), ali se celice pravilno razvijajo (izražajo in izločajo delujoče encime in lastne molekule ECM) in selijo (posamič in kolektivno). Poleg interakcij samega materiala s celicami tkiva je pomemben tudi odziv organizma, ko pride vsadek v telo (in vivo), kjer so razmere precej manj kontrolirane kot v laboratoriju. Pri običajnem vnetnem odzivu imunskega sistema makrofagi na površini tujka prepoznajo nespecifično usedle krvno-plazemske oz. medceličninske proteine ter se pripnejo nanje. Z zlivanjem v orjaške večjedrne celice želijo nato tujek zaobjeti in ga končno odstraniti iz telesa. 13 Mehanizmi zlivanja sicer niso še povsem razjasnjeni, a je za biokompatibilnost vsadka potrebno tak scenarij vsekakor čim bolj preprečiti. Tako pri in vitro kot in vivo učinkovitosti nosilca je ključnih mnogo lastnosti uporabljenega materiala: njegove biofizikalne in biokemijske značilnosti, prostorska zgradba nosilca, mehanski pogoji, ki jim je izpostavljen vzorec 3.1 Biofizikalni in biokemični vplivi Nosilec mora v prvi vrsti celicam omogočati pritrjevanje na nastavljeno ogrodje. Ker je pripenjanje na naravni ECM zelo specifično, mora nosilec ali nuditi tovrstna specifična mesta (izpostaviti ustrezna zaporedja aminokislin) ali omogočiti, da se proteini, ki jih celica izloča oz. jih dodamo v raztopino, usedejo na površino, kjer jih lahko nato celice izkoristijo za pripenjanje. Pri vezavi beljakovinskih molekul na površino se pogosto spremeni prostorska zgradba proteinov, kar lahko izpostavi ali skrije vezavna mesta. 14 Zato imajo isti proteini na različnih površinah različen vezavni učinek. Za nespecifično adsorpcijo večine proteinov so najprimernejše (zmerno) hidrofobne površine, 9,13 saj beljakovine s svojim hidrofilnim delom nadomestijo sicer manjkajoče vodikove vezi med molekulami vode in površine ter tako zgladijo energijski prehod med snovema. Ker so proteini pogosto neto negativno nabiti, se raje usedajo na površine s 8

9 3 Celice v umetnem okolju presežkom pozitivnega naboja. 9,13 Obe lastnosti povečata verjetnost adsorpcije proteinov na nosilec in s tem večjega števila vezavnih mest za celice. * Pojav ponazarja raziskava, po kateri jakost pripenjanja celic na nosilce glede na njihove kemijske skupine na površini pada v zaporedju CH 2 NH 2 > CH 2 OH > CONH 2 > COOH. 15 Aminska in karboksilna skupina sta šibki baza oz. kislina s pk a oz. pk b med 3 in 5 ter s tem pri fizioloških pogojih v povprečju rahlo pozitivno oz. negativno nabiti. Pripenjanje na mrežo po drugi strani ne sme biti premočno, saj lahko upočasni celično rast in predvsem selitev, ki je ključna za pravilen razvoj tkiv. 13 Pri in vivo vsadkih omogočajo take površine tudi lažjo vezavo makrofagov in s tem burnejši vnetni odziv. 13 Zlivanje makrofagov v orjaške celice glede na funkcionalne skupine uporabljenega materiala podobno kot v prejšnjem odstavku pada v zaporedju -N(CH 3 ) 2 > -OH = -CO-NH- > -SO 3 H > -COOH (-COONa), 16 kar se ujema z naraščajočim hidrofilnim in anionskim značajem površine. 13 Nasprotno je pripenjanje celic na fibronektin močnejša na hidrofilnih (npr. steklo) kot hidrofobnih površinah (npr. Teflon ali polietilen). 14 Hidrofilnost in naboj površine določajo molekularne lastnosti materiala nosilca ter njegova kasnejša obdelava. V polimerne materiale se lahko izbrane funkcionalne skupine vgradi na posamezne gradnike ali se jih med premreževanjem doda kot»nečistoče«. 13 Bolj specifično vezavo lahko dosežemo z dodajanjem ustreznih peptidov, npr. s prej omenjenim aminokislinskim zaporedjem RGD. Pri nekaterih celicah ima pripenjanje na omenjeni motiv še odličnejše posledice, saj lahko že sproži polarizacijo 17, kopičenje integrinov v središčne stike in pravilno organizacijo notranjega celičnega ogrodja 9 ter diferenciacijo celic domnevno zaradi večje gostote celic in posledično boljše komunikacije med njimi. 4 V nekaterih primerih je zadostna koncentracija peptidov že okoli mol/m 2, kar ustreza povprečnemu razmaku med posamezni peptidi 130 nm, torej s tovrsnimi funkcionalnimi skupinami ni potrebno prekriti celotne površine. Po drugi strani usedanje proteinov na nosilec in s tem pripenjanje celic nanj prepreči močno hidrofilna površina, denimo polietilen glikol (PEG). 9,13 Z ustrezno izbiro vezavnih predelov lahko končno določamo, katere celice se bodo vezale na izbrano mesto, z danes zelo izpopolnjenimi postopki površinske obdelave pa tudi usmerjamo razširjanje celic po površini. Pri tem je seveda potrebna velika pazljivost pri izbiri funkcionalnih mest, saj imajo komponente ECM zelo različne vloge: nekatere, ki spodbujajo rast celic, zavirajo njihovo diferenciacijo in obratno Biomehanski vplivi Poleg pravkar naštetih molekularnih dejavnikov vplivajo na življenje celic tudi mehanski dejavniki. Na površinskih gojiščih ima lahko oblika površine nosilca, tj. mikrometrske luknjice, izbokline, doline in grebeni, pomemben vpliv na oprijemanje in preseljevanje * Omenjena pravila so vedno le grobe smernice, ki imajo vedno tudi precej izjem. 13 V primeru, ko želimo raziskovati specifične interakcije med nosilcem in celicami, pridejo v poštev ravno nasprotne zahteve. 9 Navedene značilnosti površine imajo z želenim učinkom razmeroma visoko ujemanje v večini laboratorijskih raziskav, medtem ko poskusi in vivo povezave ne potrjujejo vedno. 13 9

10 Biokompatibilnost nosilcev za gojenje umetnih tkiv celic. 13 Pri tem je lahko ključna velikost tovrstnih reliefnih značilnosti, a se vplivi zelo razlikujejo med različnimi materiali in različnimi celicami. 13 Ravno tako pomembna je hrapavost na nanometrski ravni, a so lahko tudi tu učinki na različnih materialih oz. za različne celice celo nasprotni. 19,20 V marsikaterih nastajajočih tkivih o izražanju genov in sledeči diferenciaciji odločajo tudi širše mehanske lastnosti okolice: povišan tlak oz. nateg spodbudita razvoj kostnega oz. mišičnega tkiva (pri slednjih pomembno vpliva tudi molekularni nateg zaradi drsenja aktomiozinskih vlaken), 18 strižna obremenitev zaradi toka tekočine ob plasti endotelijskih celic usmeri oblikovnje žilnih sten, medtem ko sta utripajoč tlak in ritmično električno vzbujanje omogočila razvoj delujočega srca Vplivi 3D Gojenje celic na trorazsežnih nosilcih je prineslo pomemben napredek v bioloških in biomedicinskih raziskavah. Taki nosilci namreč bistveno bolje simulirajo razmere v organizmu kot petrijevke tudi celice vedo, da svet ni ploščat in tako predstavljajo pomemben kontroliran prehod med biološko že skoraj pogojno utemeljenim površinskim gojenjem ter zahtevnimi in dragimi poskusi na živalih. Z načrtovanjem uporabljenega materiala lahko nadzorujemo posamezne fizikalne in biokemične lastnosti mreže, raziskujemo njihov vpliv na celični razvoj in jih prilagajamo potrebam izbranih tkiv. Prednosti so tako mogočne, da so se v začetku tega stoletja v uglednih revijah pojavljali žal precenjeni komentarji, kot denimo»goodbye flat biology!«ter»in 10 years, anyone trying to use 2D analyses will find it difficult to be funded.«21 Dodatna dimenzija je lahko zares ključnega pomena: nekatere celice se ob presaditvi na površino dediferencirajo, ob povratku v gelsko nosilno strukturo pa ponovno razvijejo za svojo vrsto značilne lastnosti. 13 Hitrost razvoja rakavih celic je na nosilcih precej bolj podobna kot na površinah, poleg se v umetnem tkivu pojavijo tudi izpraznjena območja, podobno kot v živih primerih odmrtja tkiva ob rasti tumorjev. 21 Čeprav velika večina raziskav vseeno še vedno poteka na površinah, 21 so trorazsežni nosilci omogočili gojenje umetnih tkiv za biološko aktivne vsadke. V treh razsežnostih so osnovni biokemijski vplivi podobni že omenjenim v primeru gojenja celic na površinah, zato jih tukaj ne bomo podrobno ponavljali in se bomo raje osredotočili na ključne trorazsežne mehanske lastnosti, kot denimo poroznost snovi, topologija por, trdnost in elastičnost itd. Tovrstne lastnosti so med seboj soodvisne večja mikroskopska poroznost npr. omogoča hitrejšo izmenjavo snovi, a omejuje makroskopsko trdnost celotnega tkiva. Pri načrtovanju nosilcev jih zato ni mogoče obravnavati ločeno in zahtevajo pazljivo hkratno optimizacijo in ob danih tehničnih možnostih tudi sprejemanje kompromisov. Poroznost nosilca je odgovorna za oskrbo celic s hranili in kisikom. Pri tem nista pomembna le delež in velikost por, ampak tudi njihova povezanost in geometrija (topologija). V naravnih tkivih so celice zaradi omejene difuzije snovi, predvsem kisika, navadno oddaljene od kapilar največ µm, 14 torej bodo tudi v nosilcih večinoma preživele le do 10

11 3 Celice v umetnem okolju tolikšne globine. Izjema je hrustančno tkivo, ki uspeva tudi pri debelinah nad 1 mm. 14 Za debelejše plasti je sicer potrebno v začetku vzpostaviti aktiven tok snovi (konvekcijo), kar je še posebno pomembno za dostavo večjih molekul, npr. proteinov, 14 na daljši rok pa omogočiti rast ožilja, za kar so potrebne velikosti luknjic vsaj 0,5 mm. 22 Od velikosti por je odvisen tudi razvoj celic, saj je zanj nujno zadostno sporazumevanje med celicami v skupkih. 22 Najmanjša velikost, ki omogoča pravilno gostoto pripenjanja ter posledično diferenciacijo in rast, se od tkiva do tkiva razlikuje: nevronom zadoščajo 5 µm luknjice, medtem ko je za dermis ali kostno tkivo potrebna velikost 20 oz. 100 µm. 22 Za selitev celic in prenos snovi je ključna tudi povezanost in urejenost por; pri nekaterih poskusih se je pokazalo, da se nekatere celice v urejenem okolju, npr. v pravilni skladovnici vlaken, bolje razvijajo kot v nosilcih z naključno zgradbo. 22 Opaženo omogoča vodenje razvoja tkiva z načrtovanjem (tudi anizotropne) zgradbe nosilca. Mehanske lastnosti nosilca so pomembne tudi na makroskopski ravni: pravšnja elastičnost mreže je osnova za pravilno delovanje žilnega tkiva, trdnost za razvoj kostnih struktur, * stisljivost za celjenje ran, pri plastenju povrhnjice je ključna undulacija bazalne membrane. 23 Pri načrtovanju nosilca je zato potrebno dobro predvideti tako mikro- kot makroskopske obremenitve v izbranem tkivu, kar predstavlja velik izziv tudi za teoretično modeliranje. 22 * Celice se v pravilno tkivo razvijejo le na nosilcih z elastičnim modulom 8-11 kpa

12 4 Materiali za nosilce tkiv V začetku so za izdelavo nosilcev prevladovali materiali, pridobljeni iz naravnega ECM beljakovine in GAGi, saj zanesljivo posnemajo mehanske in biokemične lastnosti naravnih tkiv. 21 Hitro so se pokazale tudi njihove omejitve, zaradi katerih danes raje uporabljajo oz. pospešeno razvijajo umetno pridobljene snovi. Tudi za slednje je včasih veljalo, da morajo biti za uspešno uporabo z minimalnim imunskim odzivom biološko čim bolj nevtralne, danes pa se uveljavljajo materiali, ki aktivno sodelujejo s celicami in vodijo njihov razvoj Naravni biomateriali Med najbolj uporabljanimi naravnimi beljakovinami so različne vrste kolagenov, ki iz raztopine vlaken pri povišanih temperaturi in ph tvorijo mrežo. 17* Z rekombinantnimi tehnikami ga danes v evkariontih rutinsko pridelujejo in je tudi komercialno dostopen. Čeprav kolagen med proizvodnjo navadno obdelajo z encimi, ki odščipnejo majhen nestrukturiran peptid, odgovoren za imunski odziv pri prenosu snovi med različnimi živalskimi vrstami, imunokompatibilnost vseeno ni vedno vnaprej povsem gotova. 17 Težave dela tudi njegova nezadovoljiva mehanska odpornost na krčenje zaradi pripenjanja in premikanja celic, za kar so potrebni posebne metode obdelave. 17 Izdelava nosilcev je možna tudi iz fibrinov. Ker so take mreže biološko precej neaktivne, je potrebno dodajanje funkcionalnih peptidov ECM z rekombinantnimi tehnikami ali preko (ne)kovalentne vezave. 17 V nasprotju s kolagenskimi mrežami se lahko celice skozi preplet fibrinskih vlaken selijo le s proteolitsko dejavnostjo (encimskim cepljenjem beljakovin), kar vsekakor omejuje biokompatibilnost tovrstnih nosilcev. V nasprotju s proteini tvorijo iz živali izolirani ali biotehnološko proizvedeni GAGi nevlaknato gelsko strukturo z veliko količino vezane vode. Lastnosti tovrstnih hidrogelov, tj. njihovo hidrofilnost, elastičnost, biološko funkcionalnost ipd., je možno z ustreznimi spremembami do neke mere prilagoditi. Kljub vsemu so v živem tkivu razmeroma počasi razgradljivi. 17 Poleg omenjenih težav naštetih naravnih materialov imunske, biokemijske in mehanske kompatibilnosti so poglavitne omejitve množične uporabe iz ECM izoliranih snovi pridelava v velikih količinah ter zahtevana čistost in ponovljivost sestave. 17,21,23 Tovrstne zahteve lahko zadovolji le umetna sinteza novih materialov. * Zanimivo, kolagenska vlakna se zaradi negativne diamagnetne anizotropije v močnem magnetnem polju (~10 T) uredijo pravokotno nanj in tvorijo urejeno mrežo, ki lahko nato vodi rast in preseljevanje živčnih celic

13 4 Materiali za nosilce tkiv 4.2 Umetni biomateriali V prvo družino umetnih biomaterialov spadajo iz narave pridobljene snovi, ki sicer ne nastopajo v ECM, a se jih da z ustreznimi postopki predelave uporabiti tudi v ta namen, denimo svila, 4 želatina 26 ali hitinov derivat hitozan. 27,28 V drugo sodijo nerazgradljive keramike, minerali in kompozitni materiali, 21 največjo pestrost in s tem možnosti za razvoj pa ponujajo umetne polimerne snovi, katerih lastnosti so nekoliko podrobneje opisane v nadaljevanju. Osnovni gradniki so navadno aminokislinske, polisaharidne ali druge polimerne verige, ki se nato kovalentno, ionsko ali hidrofobno premrežijo. Umetni nosilci tkiv morajo za popolno opravljanje naloge čim bolj posnemati biofizikalne, biokemijske in biomehanske lastnosti naravnega ECM. Ker so v naravnem okolju interakcije tako zapletene, je potrebno poiskati najmanjšo kompleksnost, ki omogoča zadovoljiv razvoj novega tkiva. V izogib invazivnemu vsajanju se morajo nosilci sami zgraditi na zahtevanem kraju. Po zgledu beljakovin so v zadnjem času uspeli pripraviti vrsto nevlaknatih struktur, ki se v tkivu same uredijo iz dovedenih biomolekul z nekovalentnimi (hidrofobnimi ali ionskimi) interakcijami ob sprožilnem dražljaju (prisotnost določenih ionov ali večjih kemijskih skupin, spremembi temperature, ph, pod vplivom ultravijolične svetlobe ipd.). 17 Seveda je osnovna zahteva, da sestavljanje poteka pod fiziološko čim bolj sprejemljivimi pogoji. Čeprav take strukture okolico nazadnje uredijo v treh razsežnostih, je za zadovoljivo sodelovanje s celicami vedno dobrodejna njihova funkcionalizacija. Celicam lahko izpostavijo ustrezna pritrdišča v obliki omenjenih peptidnih zaporedij. V nosilec so lahko vključene tudi snovi, ki aktivno usmerjajo celični razvoj, torej rastni faktorji ipd. Lahko so kovalentno vezani na površini, tako da jih celični encimi po potrebi sami odcepljajo z mreže, zaščiteni v ovoj, katerega lastnosti določajo sproščanje zaobjete učinkovine, ali ujeti v preplet samih vlaken razgradljivega nosilca. 22 Razpad umetne mreže celicam predvsem omogoči, da ga nadomestijo z lastnim ECM. Razkroj lahko poteka s spontano hidrolizo ali, kot se večinoma dogaja v celicah, 6 preko specifičnih mest, kjer hidrolizo katalizirajo celični encimi. V obeh primerih mora biti proces časovno nadzorovan in usklajen s hitrostjo izgradnje nove medcelične mreže. 17 Ob tem je pomembno, da razpadni produkti ne spremenijo bistveno lokalnega osmotskega tlaka ali ph, da niso toksični ter da jih lahko tkivo sproti odstranjuje. 14 Za prihodnji razvoj se zdijo obetavni tudi električno prevodni nosilci. 22 Delovanje marsikaterih membranskih kanalčkov namreč uravnava električni potencial membrane, ki bi ga lahko nadzorovali z zunanjo napetostjo na nosilcu in s tem denimo krmilili sproščanje sekundarnih prenašalcev ter s tem povezano prepisovanje genov, rast celice in njeno preživetje. Temeljit nadzor nad zapletenim razvojem umetnega tkiva lahko pričakujemo le ob izdatnem razumevanju osnovnih mehanizmov pri interakcijah med celicami in nosilcem. Nekaj predlogov za napredek je navedenih v sklepnem razdelku seminarja. 13

14 5 Razglabljanje Po navedbah v zbrani literaturi je preživetje celic na nosilcih najprej odvisna od pripenjanja na mrežo. V kolikor ta ne vsebuje specifičnih vezavnih mest, mora nosilni material omogočati nespecifično vezavo proteinov, ki jih izloči celica ali se nahajajo v okoliški tekočini (npr. serumu). V večini tovrstnih primerov se bolje obnesejo hidrofobne in pozitivno nabite snovi. Tudi reliefne značilnosti na nanometrski ravni lahko vplivajo na usedanje proteinov, saj je ob neravninah na molekulo na voljo več vezavnih mest ali pa so izpostavljene druge atomske skupine. Zaradi različne molekularne strukture materialov se lahko vplivi istega parametra od snovi do snovi razlikujejo. Ko so proteini enkrat adsorbirani na površini, morajo biti celicam na voljo za pripenjanje. Na dostopnost tovrstnih mest seveda vpliva mikrometrska topografija. Celice teže dosežejo vezavna mesta na dnu ozkih in globokih dolin (v primerjavi z najmanjšim energijsko še sprejemljivim radijem ukrivljenosti celične membrane). Če so grebeni preozki, je ravno tako verjetno na voljo premalo vezavnih mest, saj se celice na ECM naravno pripenjajo z mnogo integrini skupaj na področju središčnih stikov. Morda bi lahko kakšne ideje o»počutju«celic v različnih okoljih lahko prispevale slike z vrstičnim elektronskim mikroskopom (SEM). Celica, ki se na podlago ne more pripeti, je navadno okrogle oblike, saj ima tako najmanjšo stično površino z negostoljubnim materialom za razliko od močno razpotegnjene pripete celice z mnogimi izrastki. Smiselno je pričakovati, da se lastnosti membran takih celic razlikujeta, denimo po mehanskih napetostih, kar je morda opazno z mikroskopijo na atomsko silo (AFM) ali s fluorescenčno mikrospektroskopijo (FMS). Slednja lahko morda razkrije tudi spremenjeno domensko strukturo membran, bodisi zaradi različnih lokalnih ukrivljenosti ali kopičenja integrinov. Jakost interakcij med nosilcem in celicami, ki jim je pripenjanje uspelo, bi lahko izmerili z optično pinceto. Morda bi opazili celo trganje vezi v posameznih središčnih stikih in prešteli, na koliko mestih se celice držijo podlage. Podobno bi lahko opazovali z meritvami prenosa energije fluorescence (FRET), če bi imeli na voljo integrine in fibronektine s pripetimi fluorofori blizu vezavnega mesta. Membrana je namreč za tovrstne meritve z dosegom nekaj nanometrov predaleč od nosilca (> 20 nm). Spremembe v strukturi v vezavi udeleženih beljakovin bi morda lahko raziskovali tudi s spinsko označenimi proteini in elektronsko paramagnetno resonanco (SDSL-EPR) ter pripadajočimi računalniškimi simulacijami. Če bi se v katerih od navedenih poskusov pokazale pomembne razlike, bi bilo vsekakor zanimivo raziskovanje razširiti na nadaljnje, še bolj zapletene procese komunikacije med celicami in mrežo ter posledično rast, razmnoževanje, razvijanje in preseljevanje celic. 14

15 6 Viri 1. Ramakrishna, S., Mayer, J., Wintermantel, E. & Leong, K.W. Biomedical applications of polymer-composite materials: a review. Composites Science and Technology 61, (2001). 2. Vacanti, J. & Vacanti, C.A. The history and scope of tissue engineering. Principles of Tissue Engineering (Third Edition) 3-6 (2007) 3. Verma, V., Verma, P., Ray, P. & Ray, A.R. 2, 3-Dihydrazone cellulose: Prospective material for tissue engineering scaffolds. Materials Science and Engineering: C 28, (2008). 4. Wang, Y., Kim, H., Vunjak-Novakovic, G. & Kaplan, D.L. Stem cell-based tissue engineering with silk biomaterials. Biomaterials 27, (2006). 5. Alberts, B. et al. Molecular Biology of the Cell. (Garland Science: 2007). 6. Lutolf, M.P. & Hubbell, J.A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotech 23, (2005). 7. Olsen, B.R. Matrix molecules and their ligands. Principles of Tissue Engineering (Third Edition) (2007). 8. Gahmberg, C.G. et al. Regulation of integrin activity and signalling. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 1790, (2009). 9. Hubbell, J.A. Matrix effects. Principles of Tissue Engineering (Third Edition) (2007). 10. Pierschbacher, M.D. & Ruoslahti, E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule. Nature 309, (1984). 11. Petreaca, M. & Martins-Green, M. The dynamics of cell-ecm interactions. Principles of Tissue Engineering (Third Edition) (2007). 12. Ott, H.C. et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med 14, (2008). 13. Saltzman, W.M. & Kyriakides, T.R. Cell interactions with polymers. Principles of Tissue Engineering (Third Edition) (2007). 14. Muschler, G.F., Nakamoto, C. & Griffith, L.G. Engineering principles of clinical cellbased tissue engineering. J Bone Joint Surg Am 86-A, (2004). 15. Lee, J.H., Jung, H.W., Kang, I. & Lee, H.B. Cell behaviour on polymer surfaces with different functional groups. Biomaterials 15, (1994). 16. Smetana, K., Vacík, J., Součková, D., Krčová, Z. & Scaronulc, J. The influence of hydrogel functional groups on cell behavior. Journal of Biomedical Materials 15

16 Biokompatibilnost nosilcev za gojenje umetnih tkiv Research 24, (1990). 17. Patterson, J., Martino, M.M. & Hubbell, J.A. Biomimetic materials in tissue engineering. Materials Today 13, Ingber, D.E. Mechanochemical control of cell fate switching. Principles of Tissue Engineering (Third Edition) (2007). 19. Truong, V.K. et al. The influence of nano-scale surface roughness on bacterial adhesion to ultrafine-grained titanium. Biomaterials 31, (2010). 20. Asadinezhad, A. et al. An in vitro bacterial adhesion assessment of surface-modified medical-grade PVC. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces In Press, Corrected Proof, 21. Hutmacher, D.W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nat Mater 9, (2010). 22. Luo, Y. et al. Three-dimensional scaffolds. Principles of Tissue Engineering (Third Edition) (2007). 23. Perez-Castillejos, R. Replication of the 3D architecture of tissues. Materials Today 13, Pachence, J.M., Bohrer, M.P. & Kohn, J. Biodegradable polymers. Principles of Tissue Engineering (Third Edition) (2007). 25. Dubey, N., Letourneau, P.C. & Tranquillo, R.T. Guided Neurite Elongation and Schwann Cell Invasion into Magnetically Aligned Collagen in Simulated Peripheral Nerve Regeneration. Experimental Neurology 158, (1999). 26. Dubruel, P. et al. Porous Gelatin Hydrogels: 2. In Vitro Cell Interaction Study. Biomacromolecules 8, (2007). 27. Aranaz, I. et al. Functional Characterization of Chitin and Chitosan. Current Chemical Biology 3, (2009). 28. Kim, I. et al. Chitosan and its derivatives for tissue engineering applications. Biotechnol. Adv 26, 1-21 (2008). 16