TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT. Vidrik Teder

TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT Vidrik Teder Vähidiagnostiliste peptiidide skriinimine in vivo faagidisplei meetodiga Magistritöö Juhendajad Kuldar Kõiv, MSc Ott Scheler, PhD TARTU 2014

SISUKORD KASUTATUD LÜHENDID... 4 SISSEJUHATUS... 5 1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE... 6 1.1. Kasvajate üldiseloomustus... 6 1.2. Vähistatistika ja -diagnostika... 8 1.2.1. Enamlevinud vähitüübid meestel ja naistel... 8 1.2.2. Rinnavähi diagnostika... 9 1.2.3. Eesnäärmevähi diagnostika... 10 1.3. Faagidisplei... 11 1.3.1. Üldmehhanism... 11 1.3.2. Bakteriofaagi T7 eelised... 12 1.3.3. Faagiraamatukogu in vivo selekteerimine... 13 2. EKSPERMENTAALOSA... 16 2.1. Töö eesmärgid... 16 2.2. Materjal ja metoodika... 17 2.2.1. CX 7 C T7 415-1 raamatukogu... 17 2.2.2. Faagi amplifitseerimise, puhastamise ja tiitrimise protokollid... 17 2.2.3. Peptiidi kodeeriva järjestuse kloneerimine faagi T7 vektorisse... 17 2.2.4. In vivo faagidisplei... 18 2.2.5. Ion Torrent sekveneerimine ja andmeanalüüs... 19 2.2.6. qpcr protokoll... 20 2.3. Tulemused... 21 2.3.1. Biomarkerispetsiifiliste peptiidide in vivo selekteerimine 4T1 rinnanäärmevähi mudelis... 21 2.3.2. T7 CX 7 C-faagiraamatukogu in vivo selekteerimine PC-3 eesnäärmevähi mudelis... 24 2

1.4. Arutelu... 27 Järeldused... 31 KOKKUVÕTE... 32 Summary... 33 TÄNUAVALDUSED... 35 KIRJANDUSE LOETELU... 36 KASUTATUD VEEBIAADRESSID... 40 LISAD... 41 Lihtlitsents... 53 3

KASUTATUD LÜHENDID BRCA 1 human breast cancer type 1 inimese rinnavähialge tüüp 1 BRCA 2 human breast cancer type 1 inimese rinnavähialge tüüp 2 DRE digital rectal examination digitaalne transrektaalne soolepalpatsioon HER2 human epidermal growth factor inimese epidermaalse kasvufaktori receptor 2 retseptor-tüüp 2 MRT MRI, magnetic resonance magnetresonantstomograafia tomography PC-3 human prostate cancer cell-line inimese eesnäärmevähi rakuliin pfu plaque forming unit faagilaikude arv PSA prostate-specific antigen eesnäärmespetsiifiline antigeen TRUS transrectal ultrasound transrektaalne ultraheli 4T1 mammary carcinoma cell-line hiire piimanäärmevähi rakuliin 4

SISSEJUHATUS Igal aastal diagnoositakse maailmas üle 14 miljoni uue vähijuhu ning sureb üle 8 miljoni inimese. Hinnanguliselt 30% surmadest on välditavad tervisilike eluviiside ja vähki põhjustavate viiruste vastasel vaktsineerimisel i, kuid lisaks sellele saab vähki suremust märkimisväärselt langetada haiguse varajase diagnoosimise ja õigeaegse raviga (Barton ja Harris, 1999; Moyer, 2012). Üldjoontes koosneb varajane diagnoosimine kahest peamisest komponendist: üldine teadlikkus varajaste sümptomite osas (nt emakakaela- ja rinnavähi korral) ning rutiinsete sõeluuringute läbiviimine (ebaselgete sümptomite korral). Nii on sageliesinevate vähiliikide, meestel eesnäärmevähi ja naistel rinnavähi (Siegel jt., 2014) varajaseks avastamiseks välja töötatud mitmeid meetodeid, mille kasutamine laiaulatuslikes sõeluuringutes on küsitav kalli hinna, keerukuse, madala usaldusväärsuse või tehnoloogiast tuleneva ohu tõttu (Berg jt., 2014; Harvey, 2006; Miller jt., 2003; Moyer, 2012; Orel, 1998; Žarkovski ja Ausmees, 2009; Velonas jt., 2013). Vähiteraapia on juba aastakümneid panustanud täppisravimite arendusse, et vähendada tugevalt tsütotoksiliste vähiravimite kõrvalmõjusid (Browder jt., 2000; Samoylova jt., 2006). Kasutades faagidisplei (phage display) meetodit on edukalt identifitseeritud mitmeid vähirakkude pinnal olevaid retseptoreid ja nendega seonduvaid lingande (Sugahara jt., 2010). Sellest tulenevalt eeldasime antud magistritöös, et vähispetsiifilised peptiidid annavad erinevaid kvantitatiivseid tulemusi pärast ringlemist terves ja kasvajaga hiire veres. Need, nn vähidiagnostilised peptiidid omavad kasvajaspetsiifilisi motiive, mis võimaldavad seonduda eelkõige vähiraku pinnal olevate retseptoritega (Ruoslahti, 2002b). Selleks, et kontrollida, kas vähispetsiifiliste peptiidide hulk terves ja kasvajaga hiire veres erineb pärast kindlaksmääratud ajaperioodi, viis käesoleva magistritöö autor läbi mitmeid järjestikke in vivo faagidisplei katseid, millest saadud tulemuste põhjal valideeriti Ion Torrent ja qpcr meetodil välja kõige suuremaid kvantitatiivseid erinevusi näidanud peptiide. Antud magistritöö tehti TÜ Bio-ja siirdemeditsiini instituudi Vähibioloogia uurimisgrupis. 5

1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 1.1. Kasvajate üldiseloomustus Kasvaja ehk tuumor on geneetilise materjali mutatsioonidest tingitud proliferatsiooni- ja diferentseerumishäire, mille tulemuseks on kontrollimatu rakkude kasv, küpsemine ja paljunemine. Selle tagajärjel tekib ebanormaalne rakulis-koeline moodustis ehk tuumor. Tähtis on rõhutada, et protsess on kontrollimatu, sest erinevaid koevohandeid tekib ka mitmete teistsuguste patoloogiliste protsesside korral nagu põletikud, regeneratsioon, hüpertoofia, hüperplaasia jne. Kuid sellistel juhtudel on vohangud organismi kontrolli all ja omavad kaitsekohastuslikke ülesandeid (Mesila jt., 2012). Nii vähiravis kui ka diagnostikas on oluline teha vahet paha- ja healoomulistel kasvajatel. Esimesed neist on ilma meditsiinilise sekkumiseta letaalsed, kuna annavad siirdeid ehk metastaase teistesse kudedesse, mille tõttu tekivad mitmed uued haiguskolded. Healoomulised kasvajad põhjustavad sõltuvalt oma paiknemiskohast kas lihtsalt kosmeetilisi või talitluslikke probleeme. Seda välja arvatud juhul, kui healoomuline kasvaja paikneb endokriin- või kesknärvisüsteemis, kus lokaalse mõju tõttu võib kasvaja olla eluohtlik vaatamata oma teistele tunnustele, mis pahaloomulise kasvaja arengu ja välimusega ei ühti. Pahaloomulise kasvaja põhiliseks erinevuseks healoomulisest on invasiivne kasv ehk võime tungida naaberkudedesse ja eelnimetatud uute kasvajakollete ehk siirete andmine algkoest kaugemale. Selleks kasutavad vähirakud ära organismi vere- või lümfiringet, mis võimaldab metastaseeruda üle kogu keha (Liotta ja Stetler-Stevenson, 1991). Pahaloomulised tuumorid on harilikult ka kiirema kasvuga ning sealsetes rakkudes esineb sageli nekroosi ehk koekärbumist (Mesila jt., 2012; Proskuryakov ja Gabai, 2010). Kuid kõik vähitüübid ei moodusta alati kasvajaid erandiks on näiteks leukeemia ii. Järgnevalt on kirjeldatud, mis juhtub, kui terve rakk muutub vähirakuks (Joonis 1). Inimese keha koosneb mitmetest eri tüüpi rakkudest, mis kasvavad ja jagunevad väga täpselt kontrollitud viisil, et tagada organismi terviklikkus ja töövõime. Kui aga rakud jäävad vanaks või saavad kahjustada, siis nad surevad ning asendatakse mitootilisel teel uute rakkudega. Mitoosis olevad rakud sisenevad rakutsüklisse, kus nende geneetiline materjal duplitseerub ja selle tagajärel tekivad kaks uut sama funktsiooniga tütarrakku. Selleks, et keha kasvamine ja areng toimuksid veatult, on organismil mitmeid meetmeid, mis kontrollivad, et uued duplitseerunud tütarrakud oleksid terved, funktsioneeriksid normaalselt ja replitseeruksid 6

kontrollitud kiirusega. Lisaks signaalidele, mis indutseerivad rakke mitoosi minema, on ka signaale, mis käsivad neil kasvamine lõpetada (Hanahan ja Weinberg, 2011; Weinberg, 1995). Täiendavalt on jagunevatel rakkudel kindel replikatsioonilimiit, mis on tuntud ka kui Hayflick-i nähtus. Hayflick-i nähtus varieerub olenevalt rakutüübist, kuid normaalne inimese rakk on võimeline jagunema 40-60 korda (Hayflick, 1965). Kõik rakud, mis ei talitle vastavalt või milles esinevad parandamatud vead, suunatakse apoptoosi. Selline pidev rakkude uuenemine, väljavahetamine ning erinevad pärilikud ja mittepärilikud tegurid võivad aja jooksul endaga kaasa tuua mutatsioonide kuhjumise raku DNA-s. Kui muudatused põhjustavad vigu eelnevalt mainitud rakke reguleerivates jagunemisprotsessides, siis ei pruugi defektsed rakud minna õigeaegselt apoptoosi või moodustatakse juurde rakke, mida keha ei vaja. Selle tulemusena võivad tekkida nn kasvajarakud (Burkhart ja Sage, 2008; Hanahan ja Weinberg, 2011). Vaatamata sellele, et immuunsüsteem on pidevalt valmis hävitama keha jaoks võõraid muteerunud rakke, võivad mõned vähirakud olla välimuselt väga sarnased tervetele rakkudele. Just see omapära võimaldab vähirakkudel mööda hiilida ka immuunsüsteemist iii. Joonis 1. Vähiraku tunnused. Illustreeriv joonis. Välja on toodud kuus põhilist tunnust, mille poolest vähirakk erineb tervest rakust. Pahaloomulise kasvaja arenguks piisab juba ainult kahe tunnuse olemasolust (Hanahan ja Weinberg, 2011). Tõlgitud eesti keelde. 7

1.2. Vähistatistika ja -diagnostika 1.2.1. Enamlevinud vähitüübid meestel ja naistel Hinnanguliselt on iga neljas surm Ameerika Ühendriikides seotud vähi või viimase ravi tüsistuste tagajärjel. Kuigi üldise teadlikkuse tõusu ja ennetustöö tulemusena on viimastel aastatel vähisurmade arv langenud 1-2% võrra, prognoositakse ainuüksi Ameerika Ühendriikides 2014. aastaks üle 585 000 surmaga lõppevat juhtumit (Siegel jt., 2014). Teadaolevalt on kõigest 5-10% vähijuhtumitest otseselt pärilikud ning ülejäänud 90-95% tulenevad elustiilist ja erinevatest keskkonnafaktoritest. Suurimaks haigust soodustavaks faktoriks on ülekaalulisus (30-35%), suitsetamine (25-30%) ja nakkused (15-20%) (Anand jt., 2008). American Cancer Society prognoosib, et 2014. aastal esineb meeste seas kõikidest pahaloomulistest kasvajatest kõige enam eesnäärmevähki (27%) ja naiste seas rinnavähki (29%), v.a erinevad nahavähi tüübid. Eesti Vähiregistri kõige uuemate andmete (2009. a) kohaselt oli Eestis nende vähitüüpide osakaal vastavalt 26% ja 18%. Eesti uuema statistika puudumise tõttu on tabelis 1 välja toodud kümme sagedasemat vähitüüpi Ameerika Ühendriikides. Ülekaalukalt on meeste seas suurimaks probleemiks eesnäärmevähk. Sarnast tendetsi võib näha ka naistel rinnavähi korral (Siegel jt., 2014). Tabel 1. Kümne sagedaseima vähitüübi prognoositavad esmasjuhtud 2014. aastaks Ameerika Ühendriikides. Arvestamata on jäetud basaal- ja skvamoosrakuline nahavähk ning in situ kartsinoom (v.a kusepõievähk) (Siegel jt., 2014). Tõlgitud eesti keelde. 8

1.2.2. Rinnavähi diagnostika Rinnavähk ehk rinnanäärme pahaloomuline kasvaja on üks kõige sagedamini esinevaid vähivorme naistel ning väga harvaesinev meestel (Brinton jt., 2008). Rinnanääre koosneb rasv-, side- ja näärmekoest, mis on jagatud sagarikeks. Naiste näärmesagarikest suunduvad nibusse piimajuhad ja suurem osa vähikolletest (75%) saabki alguse piimajuhade limaskestast, harvem näärmesagarikest (5-10%) iv. Igal aastal diagnoositakse Eestis üle 600 rinnavähi esmase juhu, neist üle 30% on haigus avastamise hetkel kaugelearenenud (Aareleid jt., 2005). Rinnavähk ei pruugi varajases staadiumis anda selgeid sümptomeid. Enamikel juhtudel esineb turse, valulikkus, nahamuutus või tihend rinnas, vahel ka kaenlaaluses piirkonnas. Hilisemas faasis võib märgata rinna või nibu asendi, kuju või värvi muutust. Lisaks võib esineda rinnanibu sissetõmmet ning ohumärgiks on ka nibukaudne eritis või veritsus (Padrik ja Everaus, 2013). Rinnavähi varajasel diagnoosimisel on oluline roll rinnavähi sõeluuringutel. Valdavalt on põhilisteks meetoditeks pindmine läbikatsumine ehk palpatsioon ja rindade röntgenuuring ehk mammograafia. Kui vähirakud ei ole tunginud ümbritsevatesse kudedesse, on ravi efektiivsus 98-100% v. Kuna kasvajatüki ja mitteohtliku tsüsti erinevus pole mammograafia abil tihti eristatav, siis on andmete kinnitamiseks vaja läbi viia lisauuringud, näiteks biopsia. Umbes 20%-l haigusjuhtudest ei suuda mammograaf olemasolevat vähkkasvajat leida ning pidevate kontrollimiste ohuks on tehnoloogiast tulenev kõrge kiirgusdoos (Barton ja Harris, 1999). Seetõttu viiakse alla 30-aastaste ja rasedate korral läbi ultraheliuuringuid, vahel ka mammograafilise leiu täpsustamiseks. Kuna ultraheli meetod ei ole nii tundlik haiguskollete suhtes, siis ei kasutata seda rutiinsetes sõeluuringutes. Kui on kahtlus aga mitme vähikolde olemasolule ühes rinnas, siis kasutatakse lisauuringutena magnetresonantstomograafiat (MRT), mille kõrge tundlikkus aitab paremini planeerida operatsiooni. MRT miinuseks on kõrge hind ja madal spetsiifika, mis ei võimalda vahet teha hea- ja pahaloomulisel kasvajal (Berg jt., 2014; Harvey, 2006; Orel, 1998). Lisaks on täheldatud, et umbes 20-30%-l haigetel patsientidel on kasvajas inimese epidermaalse kasvufaktori retseptor-tüüp 2 (HER2, human epidermal growth factor receptortype 2) üleproduktsioon. See retseptor reguleerib rinnanäärme epiteelrakkude arengut ja kasvu. Viga HER2 geenis põhjustab retseptorite rohkust, mis omakorda kiirendab agressiivset tüüpi rinnavähkide progresseerumist (De Abreu jt., 2014; Mitri jt., 2012). Täiendavalt tehakse ka geneetilisi sõeluuringuid, mis on kasutusel kõrgema riskifaktoriga naiste puhul, kelle lähisuguvõsas on esinenud rinnavähijuhtumeid. Geenitestide abil on võimalik leida muutusi 9

näiteks inimese rinnavähialge tüüp 1 ja 2 geenides (BRCA1 ja BRCA2, human breast cancer type 1 ja 2), mis on seotud 90% päritavate rinnavähijuhtudega. Kuigi geenitest annab täpse ülevaate vähi soodumusest, on siiski tegu veel üsnagi kalli ja mitte nii laialtlevinud meetodiga. Naistel, kellel on vigane BRCA geen, on viis korda kõrgem risk haigestuda rinnavähki. Hinnanguliselt on kõigest 5-10% rinnavähi juhtudest pärilikud (Easton, 1999; Gage jt., 2012). 1.2.3. Eesnäärmevähi diagnostika Eesnäärmevähk on selgelt kõige levinum vähitüüp meestel. Varajases arengustaadiumis olev eesnäärmevähk on üldiselt edukalt ravitav, kuid õigeaegse diagnoosimise teeb keeruliseks selgete sümptomide puudumine. Sagedamini võivad tekkida urineerimishäired, mis on põhilisteks vaegusteks ka eesnäärme healoomulise kasvaja ehk prostatiidi puhul. Harvem võib esineda verd spermas või uriinis (Miller jt., 2003). Kõige kindlam ja usaldusväärsem diagnostiline meetod on eesnäärme biopsia ehk koetüki võtmine pärasoole kaudu. Enamasti viiakse seda läbi ainult eelnevate uuringute põhjal tekkinud reaalse kahtluse korral, kuna protseduuriga kaasneb tõsine infektsioonioht ning kõrvalnähtudena võib esineda pärakukaudset veritsust ja valulikkust. Alternatiivsete võimalustena on kasutusel mitmed väheminvasiivsed meetodid nagu digitaalne transrektaalne soolepalpatsioon (DRE, digital rectal examination) või transrektaalne ultraheli (TRUS, transrectal ultrasound). Samuti aitavad täiendavalt kudede anomaaliaid tuvastada MRT või kompuutertomograafiaga. Siiski on meetoditel omad puudused nagu kõrge hind, protseduuri keerukus, kõrvalnähud ja madal spetsiifilisus (Miller jt., 2003; Žarkovski ja Ausmees, 2009; Velonas jt., 2013). Rutiinse molekulaardiagnostilise meetodina on 1986. aastast eesnäärme laiaulatusliku sõeluuringuna kasutatud PSA-teste (prostate-specific antigen, eesnäärmespetsiifiline antigeen), mis on siiani täpseim ja levinuim veremarker, mida kasutatakse erinevate eesnäärmehaiguste diagnostikas (Žarkovski ja Ausmees, 2009). PSA on spermat vedeldav ejakulaat, mida esineb väikestes kogustes meeste vereseerumis. On täheldatud, et erinevate eesnäärmeprobleemide puhul PSA näitaja veres tõuseb (Lilja, 2003; Velonas jt., 2013). Ühe uuringu kohaselt on tegu siiski ebausaldusväärse testiga ning potentsiaalne kasu ei kaalu üles valepositiivsete diagnooside ja sellest tulenevate ravi kõrvalmõjude kahjulikkust. Statistiliselt suudab PSA-test ära hoida kõigest 0-1 surma 1000-st uuringu läbinud mehest (Moyer, 2012). 10

1.3. Faagidisplei 1.3.1. Üldmehhanism Faagidisplei on meetod, mis uurib valk-valk, valk-peptiid ja valk-nukleiinhappe vahelisi interaktsioone, kasutades baktereid nakatavaid viiruseid ehk bakteriofaage. Rakupinnal olevate peptiidide uurimine ja nende äratundmine on oluline, et arendada täppisravimeid ning tõhusamaid diagnostilisi meetodeid erinevate haiguste, sh vähkkasvajate vastu (Sergeeva jt., 2006). Nii nagu vähk, on heterogeensed ka vähiga seotud biomarkerid, mis on iseloomulikud erinevatele kasvajatüvedele. Need vähispetsiifilised peptiidid raku pinnal või vereringes võimaldavad anda olulist informatsiooni vähi diagnoosimisel pahaloomulisus, kasvukiirus, staadium jne (Ruoslahti, 2002a; Samoylova jt., 2006). Veel üsnagi hiljuti tugines võitlus vähiga ainult empiirilistele koekultuuri- ja loommudelitele. Kuid sealt saadud andmed ei võimaldanud usaldusväärselt prognoosida, kui kiirekasvulise kasvajafenotüübiga oli tegu ning kui potentsiaalne on metastaaside teke. Paljudel juhtudel alustati koheselt väga agressiivsete ravimeetoditega. Sellistel puhkudel olid sagedased erinevad tüsistused, mida põhjustasid suured ravimidoosid (Browder jt., 2000; Ruoslahti, 2002a). Faagidisplei üldine kontseptsioon näeb välja selline, et faagi kattevalku kodeerivasse geeni lisatakse huvipakkuvat peptiidi kodeeriv DNA järjestus. Kuna genotüüp on seotud fenotüübiga, siis ekspresseeritakse peptiid faagi partikli pinnale (Smith, 1985). See võimaldab luua suuri faagiraamatukogusid, kus faagide pinnal saab kuvada piiramatul hulgal erinevaid peptiidseid järjestusi. Raamatukogudest omakorda selekteeritakse in vitro või in vivo katse abil välja huvipakkuvad peptiidid, mis seonduvad uuritava sihtmärgiga. Seejärel pestakse ära mittespetsiifiliselt seondunud faagid ning pärast seda on võimalik allesjäänud sihtmärkspetsiifiliste ligandidega faage paljundada E. coli-s. Nii võib läbi viia mitmeid selektsiooniringe, et afiinsuse alusel välja sõeluda kõige tugevamalt seonduvaid pinnaligande (Joonis 2). Selekteeritud ligande saab üksikasjalikumalt uurida ja identifitseerida sekveneerimise teel (Pande jt., 2010; Sergeeva jt., 2006). 11

Joonis 2. Bakteriofaag T7 faagidisplei selektsioon. T7 kapsiidivalku kodeerivasse geeni 10B sisestatakse peptiidi kodeeriv DNA järjestus, mis ekspresseeritakse faagi pinnale. Järgnevalt viiakse läbi sihtmärkseondumine, mille abil sõelutakse välja uuritava sihtmärgiga seonduvad peptiidid ning mittespetsiifilised faagid pestakse ära. Kõrgema afiinsusega seondujate leidmiseks viiakse läbi mitmeid selektsiooniringe. Joonis tehtud (Krumpe ja Mori, 2006) põhjal. 1.3.2. Bakteriofaagi T7 eelised Faagidispleis kasutatakse mitmeid bakteriviiruseid. Esimesed viirused olid filamentsed bakteriofaagid M13 ja fd. Tegu on paljuski sarnaste lüsogeensete ssdna genoomiga viirustega, mis kasutavad paljunemiseks peremeesorganismina E. coli. Kuna lüsogeensed viirused bakterirakku ei lüüsi, siis peab faagi pinnale lisatud (polü)peptiidi modifitseerima. See on vajalik viiruse väljumiseks nakatunud E. coli-st ilma viimase rakumembraani lõhkumata. Selline töötlemine aga ei sobi kõikidele valkudele, mistõttu seab see piirangud uuritavate peptiidide osas (Russel, 1991). Eelkirjeldatud probleemide vältimiseks on alternatiivse lahendusena edukalt kasutusele võetud faag T7 vi. T7 on lüütilise paljunemistsükliga dsdna genoomiga bakteriviirus, mis sarnaselt eelnevatega paljuneb nakatades E. coli rakke. Lisaks sellele on T7 faagi lihtne kasvatada ja see replitseerub kiiremini kui filamentsed faagid M13 ning fd. Kõigest kolme tunni möödudes tekivad 37 C juures faagilaigud ja kaks tundi pärast T7-ga nakatamist lüüsub E. coli vedelsöötmes. Selline tempo aitab märgatavalt kokku hoida aega, mis kuluks mitmete 12

selektiivsete kasvatamisseeriate läbiviimiseks vii. M13 eeliseks on seevastu suuremate valkude kuvamise võimalus. Pikemate insertsioonide puhul kasvatab faag M13 lihtsalt pikema kattevalkude kihi kui T7, et mahutada suuremat genoomi (Russel, 1991). 1.3.3. Faagiraamatukogu in vivo selekteerimine Faagidispleid on rutiinselt kasutatud, et selekteerida peptiidsetest faagiraamatukogudest potentsiaalseid kandidaate, mis seonduvad uuritavate biomolekulidega. In vitro katsed on aidanud identifitseerida ja uurida mehhanisme, mis on seotud erinevate retseptor-ligand interaktsioonidega. Kuid in vitro selekteerimine ei arvesta mitmete oluliste nüanssidega nagu immuunsüsteem ja arvukad rakutüübid, mis omavad tähtsat rolli täppisravimite arenduses ja diagnostikas. Nii on viimaste aastakümnete jooksul jõudsalt arenenud faagiraamatukogude selekteerimine koekultuurides, mis võimaldab kiiret ja efektiivset spetsiifiliste omadustega ligandide isoleerimist väiksest hulgast rakkudest (Hong ja Clayman, 2000). Kasutades koekultuuri rakke, on edukalt isoleeritud mitmeid kasvajaspetsiifilisi peptiide. On leitud, et kasvaja veresoontes esineb mitmeid vähispetsiifilisi biomarkereid, mida seostatakse angiogeneesi ehk veresoonkonna kasvu ja arenguga, mis on vajalik vähi kiiretempolise kasvu jaoks (Ruoslahti, 2002). Seejuures peptiidid, mis seonduvad integriinidega (transmembraansed retseptorid), on võimelised tungima raku sisemusse (Gao jt., 2003; Sugahara jt., 2010; Teesalu jt., 2009). Elusorganismide keerukuse tõttu on mitmed koekultuurist selekteeritud vähidiagnostilised peptiidid in vivo katsetes põrunud. Seetõttu on hakatud peptiide in vivo selekteerima erinevates elusorganismides, mis ei vaja otseselt mingisuguseid eelteadmisi sihtmärkretseptorite osas. Üldine in vivo selekteerimise kontseptsioon näeb välja selline, et katselooma vereringesse süstitakse kõrge peptiidse mitmekesisusega faagiraamatukogu. Seejärel lastakse kindlaksmääratud ajaperioodil bakteriofaagide kloonidel organismi vereringes ringelda. Järgnevalt teostatakse perfusioon ehk pesuetapp, et eemaldada katselooma kehast mittespetsiifiliselt kinnitunud faagid. Allesjäänud kinnitunud faagid on edaspidi hõlpsasti uuritavad, määrates nende kontsentratsiooni erinevates tervetes või kasvajakudedes. Usaldusväärsuse mõttes tehakse enamasti mitmeid selektsiooniringe, mis võimaldavad välja tuua kõige kõrgema afiinsusega faagi pinnal kuvatavaid peptiide (Joonis 3). Faagide kapsiidil oleva peptiidse järjestuse hilisem sekveneerimine võimaldab välja tuua motiive, mis on seotud näiteks mõne kindla haigusmarkeriga. Sarnast metoodikat kasutades 13

on leitud peptiide, mis kinnituvad kopsu (Rajotte ja Ruoslahti, 1999), rinna (Essler ja Ruoslahti, 2002) ja teiste organitega (Kolonin jt., 2006). Lisaks on mitmete loommudelite põhjal leitud kasvaja veresoonkonna spetsiifilisi markereid (D Onofrio jt., 2014; Liang jt., 2006). Joonis 3. Skemaatiline in vivo faagidisplei raamatukogu selektsioon. Kõrge mitmekesisusega peptiidse raamatukogu süstimine katselooma. Järgneb tsirkulatsioonietapp, kus juhusliku järjestusega peptiidid kinnituvad rakkude pinnal ekspresseeritud retseptoritega homoloogia alusel. Pärast seda viiakse läbi vereringe perfusioon, millega eemaldatakse mittespetsiifiliselt kinnitunud faagid. Järelejäänud sihtmärkspetsiifilised faagid elueeritakse uuritavast koest, amplifitseeritakse ning kasutatakse uues selekteerimisringis. Mitmete selektsiooniringide läbiviimine aitab esile tuua kõrgema afiinsusega peptiidid (Sergeeva jt., 2006). Tõlgitud eesti keelde. Kõige põhjalikumalt on kirjeldatud CendR-motiivi (C-end rule) omavaid vähispetsiifilisi peptiide. Tegu on peptiidi C-terminaalses otsas neljast aminohappest koosneva järjestusega, mis algab ja lõppeb arginiini (R) või lüsiiniga (K) R/KXXR/K (X tähistab mistahes aminohapet). CendR-järjestus seondub rakupinnaretseptoriga neuropiliin-1 (NRP-1), mis on üleekspresseeritud kasvaja veresoonte rakkudes, soodustades angiogeneesi ning mõjutades vaskulaarse läbitavuse regulatsiooni ja närvisüsteemi arengut. Üldiselt on normaalsete veresoonte seinad läbimatud, kuid kasvaja veresoontele on iseloomulik suurem läbilaskevõime. Vähemalt osaliselt on see põhjustatud ka vaskulaarse endoteeli kasvufaktori (VEGF, vascular endothelial growth factor) mõjust. Pärast NRP-1-ga seondumist transporditakse CendR-motiiviga peptiid rakku (Teesalu jt., 2009). Enimuuritud CendR-järjestusega peptiidid on RPAR ja RGDR/K ehk irgd (internalizing, sisenev-rgd). Mõlemad järjestused on võimelised tungima vähirakku, kinnitudes raku pinnal olevate retseptoritega. Erinevalt RPAR-ist ei seondu irgd koheselt NRP-1-ga. Algselt seondub irgd αv-integriinidega. Seejärel viiakse rakupinnal olevate proteaaside poolt läbi 14

proteolüütiline lõikamine, mille tõttu kaotab irgd suure osa oma esialgsest seondumisaktiivusest integriinidele. Alles lõigatud peptiid on võimeline seonduma NRP-1-ga, mis transpordib lühenenud peptiidi läbi veresoone seina kasvajasse (Sugahara jt. 2010). Suur osa in vivo faagidisplei eksperimentidest viiakse läbi erinevate hiireliinide peal. Süstides neisse inimesest eraldatud kasvajarakuliine, on loodud mitmeid vähkkasvajate mudeleid. Nii on tehtud kõhunäärmevähi mudel, et faagidisplei abil uurida healoomulise kasvaja muutumist pahaloomuliseks (Joyce jt., 2003). Lisaks hiirtele on alternatiivselt kasutusele võetud nii rotte, putukaid kui ka kalu (Mullen jt., 2006; White jt., 2013; Work jt., 2006). Loommudelite abiga saadud sihtmärkmotiivid ei ole siiski alati üheselt ülekantavad loomadelt inimestele. Näiteks võib esineda liikidevahelisi lahknevusi sihtmärkide mustrites, kuna inimese ja hiire vaskulaarsed retseptorid võivad erineda. Kuid on ka näiteid, kus loommudelite kasutamine peptiidide valideerimisel on ennast homoloogia olemasolu korral õigustanud (Arap jt., 2002). 2002. aastal jõuti esimest korda nii kaugele, et sobivate peptiidide valideerimine viidi läbi patsiendis. Teadlaste sihtmärkideks olid arvukad inimese veresoonkonnas olevad retseptorid. Lõppkokkuvõttes uuriti pea 50 000 peptiidset motiivi, mis kinnitusid erinevates organites. Järgnenud suuremahuline analüüs kinnitas, et peptiidide jaotus kudedes ei olnud juhuslik ja valideeriti mitmeid vaskulaarseid ligande (Arap jt., 2002). 15

2. EKSPERMENTAALOSA 2.1. Töö eesmärgid Käesoleva magistritöö praktilise osa eesmärgiks oli faagidisplei abil leida vähidiagnostilisi peptiide, mille esindatus pärast veres ringlemist oleks erinev tervetes ja tuumoritega hiirtes. 1. Diagnoosida vereseerumist võetud proovi põhjal 4T1 tüüpi piimanäärmevähi olemasolu BALB/c hiirtes, kasutades varasemalt kirjeldatud biomolekulidega seonduvaid peptiide. 2. Leida de novo bakteriofaagil T7 kuvatavaid peptiide, mis võimaldavad diagnoosida vereseerumist võetud proovi põhjal inimese eesnäärmevähi PC-3 olemasolu nude- Fox1nu hiirtes. 16

2.2. Materjal ja metoodika 2.2.1. CX 7 C T7 415-1 raamatukogu Peptiidiraamatukogu oligonukleotiidne järjestus pandi kokku seitsme trinukleotiidse NNKbloki põhjal, mille alusel kodeeritakse järgemööda seitse juhuslikku aminohapet. Võimalikult suure mitmekesisuse saamiseks on igas NNK-blokis olev N (1. ja 2. positsioonis) juhuslikult üks neljast nukleotiidist - adeniin (A), tümidiin (T), tsütosiin (C) või guaniin (G). Stoppkoodonite vähendamiseks on K (3. positsioonis) kas tsütosiin (T) või guaniin (G). Nii genereeritakse 10 9 erinevat peptiidset järjestust, mille otstes on tsüsteiinid. Tsüsteiinide vahel moodustuvad disulfiidsillad, mille tõttu muutub viiruse kapsiidil kuvatav peptiidne järjestus tsükliliseks. Informatsioon NNK CX 7 C T7 415-1 raamatukogu koostamise kohta on kättesaadav (Teesalu jt., 2012) artikli metoodikas. 2.2.2. Faagi amplifitseerimise, puhastamise ja tiitrimise protokollid E. coli bakterikultuuride (Novagen, USA) kasvatamine ja nendes bakteriofaagi T7 amplifitseerimine, puhastamine ja tiitrimine toimus vastavalt TÜ vähibioloogia labori protokollidele (vt Lisa 1-3). 2.2.3. Peptiidi kodeeriva järjestuse kloneerimine faagi T7 vektorisse Oligonukleotiidid kloneeriti T7 multikloneerimissaiti, mis vastutab viiruse pinnale kuvatava peptiidi ekspressiooni eest. Multikloneerimissait asub kapsiidivalku kodeeriva geen 10B EcoR I ja Hind III lõikamissaitide vahel viii. Kloneeritavate oligonukleotiidide paardumiseks segati kokku komplementaarsed sense ja antisense oligonukleotiidid (Metabion, Saksamaa) (Tabel 5 ja 6; vt Lisa 4-5) lõppkontsentratsioonis 80 nm. Järgnevalt inkubeeriti segu 10 min kuivtermoblokis (Biosan, Läti) 80 C juures ning seejärel lülitati termoblokk välja ja jätkati inkubatsiooni kuni toatemperatuurini jahtumiseni (~2 h). Siis lisati 1 µl paardunud oligonukleotiide ligeerimissegusse lõppmahus 5 µl, kus oli järgmisi reagente vastavates lõppkontsentratsioonides: lõigatud vektor (vector arms, 10 ng/µl; Novagen, USA), 1x T4 DNA ligaasi puhver ja T4 DNA ligaas (1 Weiss U/µl; Thermo Fisher Scientific Inc, USA). Seejärel lasti reaktsioonil seista üleöö toatemperatuuril, mille järel lisati 5 µl T7 pakkimisekstrakti (Packaging Kit Extracts, Novagen, USA) ning inkubeeriti uuesti 2 h ruumitemperatuuril. 17

Kloneerimise õnnestumise kontrollimiseks sekveneeriti kolooniad. Selleks lisati eelnevale reaktsioonisegule 120 µl LB-d (Sigma-Aldrich Co, USA) ning tiitriti. Kolooniate tekkimisel kaabiti pipetiotsikuga Petritassil olevast faagikolooniast materjali ja otsik asetati 10 minutiks 30 µl-sse 1x PBS-i (PAA, Austria) orbitaalloksutile (Biosan, Läti). Seejärel valmistati sekveneerimiseks ette reaktsioonisegu lõppmahus 15 µl, mis sisaldas 1 µl faagi DNA-d PBSis (PAA, Austria) ja järgmisi reagente vastavates lõppkontsentratsioonides: 1x HOT FIREPOL Blend Master mix (Solis BioDyne, Eesti), praimerid (0,2 µm; Metabion, Saksamaa; Tabel 7; vt Lisa 6). PCR-reaktsiooni läbiviimiseks kasutati Eppendorf Master Cycler Nexus (Eppendorf AG, USA) termotsüklerit ja programm oli järgnev: 95 C 12 min 95 C 30 sek 50 C 30 sek 35x 72 C 20 sek 72 C 10 min 4 C STOPP Proovid sekveneeriti Sangeri meetodiga Eesti Biokeskuse tuumiklaboris. 2.2.4. In vivo faagidisplei Kõik loomkatsed teostati loomakaitseseaduse kohaselt loomkatse loa nr 90 alusel (vt Lisa 10). Kõik loomkatsed viidi läbi litsentsi omava TÜ vähibioloogia uurimisgrupi teaduri Tarmo Mölderi juhendamisel ja järelvaatamisel. Loomkatsed tehti emastes BALB/c või isastes immuunpuudulikes karvututes nude-fox1nu hiirtes (Harlan Laboratories Inc, USA), kelle vanus (~2-6 kuud) ning kaal (~25-30 g BALB/c; ~28-34 g nude) katsetes varieerusid. Katsete käigus kasutati 16 looma. Katsed teostati TÜ arstiteaduskonna vähibioloogia laboris, katseloomi hoiustati TÜ arstiteaduskonna Biomeedikumi vivaariumis 12 tunni valguse/pimeduse tsükli tingimustel, vaba juurdepääsuga veele ja toidule. Olenevalt katsest indutseeriti hiirtes nahaaluseid kasvajaid inimese eesnäärmevähi PC-3 või hiire rinnavähi 4T1 rakuliinidega 1. Nahaaluse vähi indutseerimiseks süstiti ~10 6 vähirakku 5-50 µl PBS-is (PAA, Austria) nahaaluselt looma alaseljale. Kõigi implanteeritud 1 Kasvajad indutseeris litsentsi omava TÜ vähibioloogia uurimisgrupi teadur Tarmo Mölder 18

vähkkasvajatega hiirte heaolu hinnati igapäevaselt: seiresüsteem hõlmas kehahoiaku, kõnnaku ja kasvaja suuruse ning seisundi hoolikat jälgimist ning loomi kaaluti ja palpeeriti iga kahe päeva järel. In vivo katse viidi läbi, kui kasvaja oli arenenud diameetrini 1,2 cm või kaalulangus ületas 10% kehamassist. PC-3 mudeli puhul oli ajaperioodiks ~3 nädalat ja 4T1 mudelil ~10 päeva pärast süstimist. Katsete käigus süstiti (Becton, Dickinson and Company, USA süstal 0,5 ml ja nõel 0,3 x 0,8 mm) katseloomade sabaveeni ~100 µl faagisuspensiooni PBS-is (PAA, Austria). Süstitav faagisuspensioon ning veres ringlemise aeg sõltusid konkreetsest katsest ning on täpsemalt kirjeldatud iga katse juures eraldi. Pärast faagisuspensiooni veres ringlemist kindla ajaperioodi järel süstiti (Becton, Dickinson and Company, USA süstal 0,5 ml ja nõel 0,3 x 0,8 mm) katselooma kõhuõõnde üldanesteetikumi Avertin (tribromoetanool) (Sigma-Aldrich Co, USA). Ühe grammi katselooma kaalu kohta süstiti 10 µl 2,5%-st tribromoetanooli lahust 2. Anesteesia all oleva katselooma rindkere avamise järgselt koguti südamest 200 µl verd eelnevalt 0,5 M EDTA-s (Sigma-Aldrich Co, USA) pestud süstlaga (Becton, Dickinson and Company, USA süstal 0,5 ml ja nõel 0,3 x 0,8 mm), et vältida vere hüübimist süstla nõelas. Vere võtmise järel katseloom hukati veretustamise teel. Veres ringelnud faagi tiitri määramiseks lisati 200 µl verele 1 ml eelnevalt valmistatud LB söötme ja IGEPAL CA-630 lahust (100:1) (Sigma-Aldrich Co, USA). Lähtuvalt katse eesmärkidest eraldati 200 µl-st puhtast verest DNA. DNA (sh bakteriofaagi DNA) eraldamiseks katselooma verest kasutati kommertsiaalset High Pure PCR Template Preparation Kit i (Roche Holding AG, Šveits). DNA puhastamine viidi läbi vastavalt kaasasolevale protokollile. 2.2.5. Ion Torrent sekveneerimine ja andmeanalüüs Bakteriofaagil kuvatavate peptiidide kvantifitseerimiseks ja sekveneerimiseks kasutati teise põlvkonna kõrge läbilaskevõimega Ion Torrent sekveneerimisplatvormi (Thermo Fisher Scientific Inc, USA). Ion Torrent edastab saadud andmed FASTAQ failiformaadis, mille analüüsimisel kasutatakse laborisisest pdparser programmi 3. Pdparser transleerib iga DNA järjestust kuues lugemisraamis ja otsib MLGDPNS motiivi, millele järgnevad peptiidid 2 Valmistanud TÜ vähibioloogia laborispetsialist Kaarel Kurm 3 Loonud TÜ vähibioloogia bioinformaatik Aleksandr Sudakov 19

salvestatakse kuni stoppkoodonini. Seejärel loendatakse ja sorteeritakse salvestatud peptiidid. Väljundiks on tekstifail, mis sisaldab peptiidide järjestusi ja nende arvu sisendandmetest. Ion Torrent analüüside ettevalmistamiseks läbiviidav PCR-i reaktsioonisegu segati kokku lõppmahus 25 µl, kus oli 5 µl faagisuspensiooni (DNA) ja järgmisi reagente vastavates lõppkontsentratsioonides: 1x HOT FIREPOL Blend Master mix (Solis BioDyne, Eesti), praimerid (0,2 µm; TAG Copenhagen AS, Taani; Tabel 8; vt Lisa 6). PCR-i läbiviimiseks kasutati Eppendorf Master Cycler Nexus (Eppendorf AG, USA) termotsüklerit ja programm oli järgnev 4 : 95 C 12 min 95 C 20 sek 62 C 20 sek 20x 72 C 10 sek 72 C 10 min 4 C STOPP 2.2.6. qpcr protokoll qpcr-i katses kasutati dsdna-ga seonduvat EvaGreen värvi, mis on HOT FIREPOL Blend Master mix koostises (Solis BioDyne, Eesti). Reaktsioon viidi läbi 10 µl lõppmahus ja lisaks 1 µl-le faagi DNA-le sisaldas reaktsioonisegu lõppkontsentratsioonis järgnevaid komponente: 1x HOT FIREPOL Blend Master mix (Solis BioDyne, Eesti) ja praimerid (0,2 µm; Metabion, Saksamaa; Tabel 9; vt Lisa 7). qpcr-i läbiviimiseks kasutati PikoREAL96 qpcr-i reaalaja termotsüklerit ja absoluutne kvantitatiivsus määrati PikoReal Software 2.2 tarkvaraga (Thermo Fisher Scientific Inc, USA). qpcr-i programm oli järgnev: 95 C 10 min 92 C 15 sek 58 C 1 min 92 C 15 sek 60 C 1 min 4 C STOPP 5x 40x 4 Ion Torrent-i analüüsid viisid läbi TÜ vähibioloogia laborispetsialist Kaarel Kurm ja teadur Tarmo Mölder 20

2.3. Tulemused 2.3.1. Biomarkerispetsiifiliste peptiidide in vivo selekteerimine 4T1 rinnanäärmevähi mudelis Katse eesmärk oli võrrelda varasemalt kirjeldatud biomolekulidega seonduvate bakteriofaagi T7 pinnal ekspresseeritud peptiidide veres ringlemise erinevusi terves ja kasvajaga hiirte vereseerumis, mille põhjal oleks võimalik diagnoosida 4T1 rinnanäärmevähi olemasolu BALB/c hiire mudelis. Esimesel faagide in vivo selektsiooniringil süstiti 100 µl (10 10 pfu/ml) teadaolevalt biomolekulidega seonduvat faagisuspensiooni (Tabel 11; vt Lisa 8) kahe terve ja kahe kasvajaga hiire sabaveeni. Suspensioonil lasti katseloomade vereringes ringelda 15 minutit. Sellele järgnevalt viidi hiired üldanesteesiasse ja koguti südamest 200 µl verd, millest eraldati DNA. Eraldatud DNA-st paljundati kapsiidi pinnale peptiidi kodeeriv järjestus, milleks kasutati PCR-praimereid (Tabel 8; Lisa 6). Saadud PCR-produktid sekveneeriti ja kvantifitseeriti Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific Inc, USA) platvormil. Seitse peptiidi näitasid suuremat kvantitatiivset erinevust tervetes ja kasvajatega hiirtes, kusjuures neli peptiidi (CRATRGDKC, CNRRTKAGC, CQLIIQKNEC ja CGSRGARSC) esinesid ainult kasvajaga hiirte vereproovides (Joonis 4). CG 7 C on kontrollpeptiid, mis teadaolevalt ei oma in vivo mingisugust efekti biomolekulidega seondumisel (Teesalu jt., 2012). Erinevatest hiirtest saadud andmeid normaliseeriti peptiidide koguhulga vastu. 21

JÄRJESTUSTE ARV 100 000 Peptiidide sagedustabel esimese in vivo katse järel 15 min 10 000 1 000 100 TERVE (n=2) 4T1 TUUMOR (n=2) 10 FAAGI PINNAL KUVATAV PEPTIIDNE JÄRJESTUS Joonis 4. Biomarkerispetsiifiliste peptiidide in vivo esimesel selektsioonilringil suurimaid erinevusi andvad peptiidid tervetes ja tuumoriga hiirtes. Katses võrreldi faagidisplei meetodil varasemalt kirjeldatud biomolekulidega seonduvate peptiidide veres ringlemise erinevusi tervetes ja tuumoriga hiirtes. Ion Torrent-i andmetest. Veapiirid on arvutatud standardhävete põhjal. Järgnevalt kloneeriti seitse selekteeritud peptiidset järjestust T7 415-1b vektorisse ja ekspresseeriti faagi pinnale. Kloneeritud järjestused sisaldasid endas ka qpcr-i praimeritega komplementaarseid järjestusi hilisemaks absoluutse kvantitatiivuse määramiseks (Tabel 5; vt Lisa 4). Teisel in vivo valideerimisel süstiti suspensioonina kaheksa võrdse tiitriga faagi kahe terve ja nelja 4T1 kasvajaga emase hiire sabaveeni ning 15 minuti järel võeti verd, millest eraldati DNA. Teistkordne in vivo faagidisplei tulemuste valideerimine viidi esmalt läbi Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific Inc, USA) platvormiga. Statistiliselt usaldusväärne erinevus esines CRGDKGPDC peptiidi puhul (p 0,05) (Joonis 5A). CRGDKGPDC oli terves hiires keskmiselt 12 korda enam esindatud kui 4T1 tuumoriga hiires (Joonis 5B). Täpsed arvulised väärtused on leitavad tabelis 10 (vt Lisa 7). 22

PEPTIIDIDE ESINDATUSE ERINEVUS TERVES JA TUUMORIGA HIIRES (KORDADES) JÄRJESTUSTE ARV A 100 000 Peptiidide sagedustabel teise in vivo katse järel 15 min 10 000 1 000 100 10 TERVE (n=2) 4T1 TUUMOR (n=4) FAAGI PINNAL KUVATAV PEPTIIDNE JÄRJESTUS B 14 12 10 8 6 4 2 0 Peptiidide suhe terves ja tuumoriga hiire vereseerumis 15 min TERVETE keskmine (n=2) / TUUMORITE keskmine (n=4) FAAGI PINNAL KUVATAV PEPTIIDNE JÄRJESTUS Joonis 5A ja 5B. Biomarkerispetsiifiliste peptiidide in vivo teisel selektsioonilringil suurimaid erinevusi andvad peptiidid tervetes ja tuumoriga hiirtes. Katses võrreldi faagidisplei meetodil varasemalt kirjeldatud biomolekulidega seonduvate peptiidide veres ringlemise erinevusi tervetes ja tuumoriga hiirtes. Ion Torrent-i andmetest. Veapiirid on arvutatud standardhävete põhjal. 23

PEPTIIDIDE ESINDATUSE ERINEVUS TERVES JA TUUMORIGA HIIRES (KORDADES) Saadud Ion Torrent-i andmeid kinnitati qpcr-iga kasutades absoluutset kvantifitseerimist. Joonisel 6 on toodud andmed, milles qpcr-iga kvantifitseeriti kõige enam erinenud peptiidi (CRGDKGPDC) esindatust teistkordse in vivo selekteerimisringi proovidest. irgd suhe terve ja tuumoriga hiire vereseerumis 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 15 min TERVETE keskmine (n=2) / TUUMORITE keskmine (n=4) FAAGI PINNAL KUVATAV PEPTIIDNE JÄRJESTUS Joonis 6. In vivo teisel selektsioonilringil suurimat erinevust andva CRGDKGPDC peptiidi erinevus tervetes ja tuumoritega hiirtes. Katses võrreldi faagidisplei meetodil selekteeritud CRGDKGPDC peptiidi veres ringlemise erinevust tervetes ja tuumoriga hiirtes. qpcr-i andmetest. 2.3.2. T7 CX 7 C-faagiraamatukogu in vivo selekteerimine PC-3 eesnäärmevähi mudelis Katse eesmärgiks oli leida de novo bakteriofaagi T7 pinnal ekspresseeritud peptiidide veres ringlemise erinevusi terves ja kasvajaga immuunpuudulike hiirte vereseerumis, mille põhjal oleks võimalik diagnoosida PC-3 eesnäärmevähi olemasolu nude-fox1nu hiire mudelis. Esimeses in vivo selektsiooniringis süstiti 100 µl (10 10 pfu/ml) vähendatud mitmekesisusega (~10 5 ) CX 7 C-raamatukogu ühte tervesse ja ühte PC-3 tuumoriga nude-fox1nu hiirde ning seejärel lasti ringleda 1 tund. Järgnevalt viidi katseloomad üldanesteesiasse ning võeti südamest 200 µl verd. Verest eraldatud DNA-st paljundati kapsiidi pinnal olevat peptiidi kodeeriv järjestus, selleks kasutati PCR-praimereid (Tabel 8; vt Lisa 6). Saadud tulemused sekveneeriti ja kvantifitseeriti Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific Inc, USA) platvormi abil. Esimese valideerimise põhjal valiti pdparser programmiga 13 järjestust, mis andsid tervetes ja PC-3 tuumoriga nude hiirtes suurimaid erinevusi (Joonis 7). 24

JÄRJESTUSTE ARV 10000 Peptiidide sagedustabel esimese in vivo katse järel 1 h 1000 100 10 TERVE (n=1) PC3 TUUMOR (n=1) 1 FAAGI PINNAL KUVATAV PEPTIIDNE JÄRJESTUS Joonis 7. CX 7 C-raamatukogu in vivo esimesel selektsiooniringil suurimaid erinevusi andnud faagid terves ja tuumoriga hiires. Katses võrreldi faagidisplei meetodil madaldatud mitmekseisusega (10 5 ) CX 7 C- raamatukogu peptiidide veres ringlemise erinevusi terves ja tuumoriga hiires. Ion Torrent-i andmetest. Järgmises etapis ekspresseeriti 13 väljavalitud peptiidset järjestust T7 faagi pinnal ja viidi läbi teine in vivo valideerimine kahes terves ja kahes tuumoriga PC-3 nude hiires. 1 tund pärast süstimist võeti hiirtelt 200 µl verd, millest eraldati kapsiidil oleva peptiidi kodeeriva järjestuse DNA, kasutades praimereid (Tabel 8; vt Lisa 6). Järgneva Ion Torrent analüüsi põhjal oli esmasel vaatlusel märgatav erinevus kahel faagil kuvatava peptiidi puhul CNKEGRATC ja CDKEGRESC (Joonis 8). Kuna p-väärtused olid vastavalt 0,06 ja 0,33, ei ole nende peptiidide erinevus terves ja tuumoriga hiires statistiliselt usaldusväärne. Täpsed arvulised väärtused on leitavad tabelis 12 (vt Lisa 9). 25

JÄRJESTUSTE ARV 100000 Peptiidide sagedustabel teise in vivo katse järel 1 h 10000 1000 TERVE (n=2) PC3 TUUMOR (n=2) 100 FAAGI PINNAL KUVATAV PEPTIIDNE JÄRJESTUS Joonis 8. CX 7 C-raamatukogu in vivo teisel selektsiooniringil suurimaid erinevusi andnud faagid tervetes ja tuumoriga hiirtes. Katses võrreldi faagidisplei meetodil madaldatud mitmekseisusega (10 5 ) CX 7 C- raamatukogu peptiidide veres ringlemise erinevusi tervetes ja tuumoriga hiirtes. Ion Torrent-i andmetest. Veapiirid on arvutatud standardhävete põhjal. 26

1.4. Arutelu Võitluses vähiga on oluline teha vahet tervel ja kasvajarakul ning diagnoosida haigust võimalikult varajases staadiumis. Õigeaegsel diagnoosimisel on vähkkasvajad üldiselt edukalt ravitavad, kuid sellises järgus kasvajateni jõutakse enamasti juhuslike või rutiinsete kontrollide käigus. Selgete ja märgatavate sümptomite esinemisel on haigus enamasti juba kaugele arenenud. Hetkel on kliinilises praktikas kahe sageliesineva pahaloomulise kasvaja (eesnäärmevähk meestel ja rinnanäärmevähk naistel) diagnoosimisel kasutusel mitmed erinevad meetodid. Paraku ei sobi mitmed neist laiaulatuslikeks sõeluuringuteks protseduuride keerukuse tõttu ja/või ei ole piisavalt usaldusväärsed (Harvey, 2006; Moyer, 2012; Orel, 1998). Käesoleva töö eesmärgiks oli uurida, kas tuumorispetsiifiliste peptiidide süstimisel hiirtesse ja hilisemal vereproovi võtmisel on võimalik diagnoosida inimese rinna- ja eesnäärmevähki in vivo loommudelis. Selleks koostati kaks paralleelset katseskeemi: (1) rinnavähimudeli korral üritati leida faagide kvantitatiivne erinevus kindla ajapunkti järel 4T1 tuumoriga ja terves emases BALB/c hiire vereproovis, olles hiirtesse süstinud teadaolevalt biomolekulidega seonduvate faagide suspensiooni; (2) eesnäärmevähi mudeli puhul püüti analoogselt identifitseerida de novo peptiide, mille ringlemise erinevus terves ja PC-3 tuumoriga isases nude-fox1nu hiire veres võimaldab diagnoosida eesnäärmevähi olemasolu. Mõlema katseskeemi ülesehitus põhineb in vivo faagidisplei meetodil. Antud tehnoloogia võimaldab identifitseerida peptiide, mis seovad ennast kasvajarakkude või nende poolt ekspresseeritavate biomolekulidega. Teadaolevalt omab iga organ või patoloogiline kasvaja unikaalset vaskulaarset eripära, mille äratundmine on määrava tähtsusega sihtmärgispetsiifiliste ligandide leidmisel (Teesalu jt., 2012). Vaskulaarsed endoteelirakud, mis katavad veresoonte sisepindu, annavad informatsiooni kasvajate arengu kohta. Tuumorite suurenedes ja edasise kasvu tagamiseks vajaminevate veresoonte areng ja ehitus on mitmeti erinev normaalsest angiogeneesist (Ruoslahti, 2002b). Keskendudes nendele erinevustele üritati antud töös näidata, et kasutades vähispetsiifilisi peptiide, on võimalik kindlaks teha pahaloomuliste kasvajate olemasolu vereproovi põhjal loommudelites. Tuginedes varasemalt identifitseeritud vähispetsiifilistele biomarkeritele ja nendega seonduvatele peptiididele koostati katseskeem (1), kus püüti näha erinevust terve ja kasvajaga hiire vereproovis pärast faagisuspensiooni süstimist ja veres ringlemist. Sellest tulenevalt uuriti antud in vivo katses, kas on võimalik leida kvantitatiivset erinevust kontrollfaag CG 7 C 27

ja varasemalt kirjeldatud biomarkeritega seonduvate faagide vahel. Kahekordsel in vivo faagidisplei selekteerimisetapil andis ainsana statistiliselt usaldusväärse tulemuse peptiid CRGDKGPDC, mille vereseerumis püsimine 15 minutilise ringlemise järel on kordades suurem terves hiires. Tulemus oli igati ootuspärane, kuna varasemalt on kirjeldatud, et CRGDKGPDC peptiidis olev RGD järjestus on kasvajaspetsiifiline, seondudes αvintegriinidega (Sugahara jt., 2010). Tundub tõenäoline, et võime tungida kasvajarakkudesse soodustab CendR-motiiviga CRGDKGPDC peptiidil kogunemist kasvajakoesse, mistõttu viimase vabalt veres ringlemise hulk väheneb märgatavalt. Julgustavaks faktiks on ka kontrollpeptiidi CGGGGGGGC ühtlane tase terves ja tuumoriga hiires. Teadaolevalt ei kinnitu kontrollpeptiid ühelegi biomolekulile, seega on selle tase veres usaldusväärseks negatiivseks kontrolliks (Teesalu jt., 2012). Kuigi esimesel selektsiooniringil andsid Ion Torrent analüüsi põhjal paljulubavaid tulemusi mitmed teisedki peptiidid, siis teistkordsel seitsme peptiidisegu võrdlemisel selged erinevused kadusid (v.a CRGDKGPDC). Mõlemas selektsiooniringis täitis kriteeriumi ainult CRGDKGPDC peptiid, mis näitas kõigis kümnes katseloomas selgeid erinevusi. Teiste peptiidide varieeruvuse taga võib olla mitmeid põhjuseid. Näiteks suurema mitmekesisusega raamatukogude süstimisel võib esineda peptiidide vahel konkureerivat või inhibeerivat toimet üksteise suhtes, mis võib omakorda anda valepositiivseid või negatiivseid tulemusi. Teisalt ei pruugi algses selekteerimata raamatukogu algsuspensioonis olla kõiki peptiide võrdsel määral. Nii võivad detekteerimata jääda väheesindatud tuumorispetsiifilised peptiidid. Selle vältimiseks mõõtsime alglahuses olevate peptiidide hulka. Kuigi qpcr täpsus on kõrge, ei ole mõeldav sellega suurte raamatukogude valideerimine: kõigi peptiidide jaoks oleks vaja läbi viia eraldi analüüsid. Seetõttu on Ion Torrent sobilik just suurte raamatukogude valideerimiseks. Peale selle võimaldab Ion Torrent platvorm määrata ka sekveneeritud DNA molekulide hulka. Ion Torrent-iga saab küll mõõta proportsionaalseid suhteid, aga kui eesmärgiks on võrrelda absoluutseid erinevusi, siis on qpcr-i andmed täpsemad ja usaldusväärsemad. Sellepärast viidi ka antud katses lõplik valideerimine paralleelselt läbi nii Ion Torrent kui ka qpcr meetodil: omavahel võrreldi kontrollpeptiidi (CG 7 C) ja sellest suurimat erinevust näidanud CRGDKGPDC peptiidi hulka. Tulemuste põhjal näitas Ion Torrent CRGDKGPDC peptiidi puhul keskmiselt ligikaudu 12-kordset ja qpcr kolmekordset erinevust terves ja tuumoriga hiires. Siiski, keskendudes esialgsetele tulemustele, on näha mõlemal juhul mitmekordset erinevust tuumoriga ja terve hiire vereproovis. Süstitavas suspensioonis oli veel teisigi teadaolevalt kasvajatega seonduvaid järjestusi - CARPAR ja CRETTAWAC (Koivunen jt, 1994; Teesalu jt., 2009). Seetõttu oleks oodanud sarnast 28

tendentsi ka nende proovidest. CARPAR ja GRETTAWAC järjestuste puhul oli küll näha sarnast seost, kuid mõlemal juhul puudus arvestatav erinevus ühes neljast tuumoriga katseloomas. Edasiste katsete käigus on plaanis suurendada statistilist usaldusväärsust tõstes katseloomade arvu ja uurida täpsemalt kolme (CRGDKGPDC, CARPAR, CRETTAWAC) peptiidse järjestuse veres püsimist. Katseskeem (2) oli erinevalt eelnevast kavandatud leidmaks de novo peptiidseid ligande. Kuna mõlema katse eesmärgid on diagnostilises mõttes täiesti uutmoodi lähenemised, siis juhusliku peptiidse raamatukogu süstimisel kasutasime immuunpuudulikke hiiri. Seda tehti eeldusel, et see kergendab juhuslikust raamatukogust vähispetsiifiliste ligandide selekteerimist, kuna olulist rolli in vivo katsetel mängib elusorganismi bioloogiline keerukus. Tuleb arvestada mitmete bioloogiliste barjääride ja iseärasustega, nagu vereseerumi stabiilsus, immuunsüsteem ja vere puhastamine kehale võõratest komponentidest ning otsene juurdepääs rakkudele (Brown, 2010). Antud katses süstiti PC-3 kasvajaga nude-fox1nu hiirde NNK CX 7 C-raamatukogu, kus esineb 10 5 erinevat kuni 7 aminohappe pikkust järjestust. Esimeses in vivo selekteerimisringis saadi kahes katseloomas 21 peptiidi, mis oluliselt erinesid terve ja tuumoriga hiire vereseerumis. Need omakorda jagunesid 12 erineva motiiviga peptiidiperekondadesse, mille põhjal valiti igast perekonnast üks-kaks kõige paremat tulemust andnud peptiidi kokku 13. Järgnevalt viidi läbi in vivo faagidisplei teistkordne selekteerimine, kuhu negatiivse kontrollina oli lisatud CG 7 C. Lõplike tulemuste põhjal statistiliselt erinevaid de novo peptiide ei esinenud. Tulemuste esialgsel vaatlusel eristusid kaks sarnase motiiviga peptiidi (CNKEGRATC ja CDKEGRESC), kuid statistiline usaldusväärne erinevus puudus. Kontrollil t-testiga oli CNKEGRATC-i p-väärtus 0,054 (lubatud <0,05). Tegu on järjekordse uue CendR-järjestusega, mis viitab peptiidi vähispetsiifikale seondudes ilmselt NRP-1 retseptorile (Teesalu jt., 2009). Teise selektsiooniringi järel oli näha ka kontrollpeptiidi CG 7 C tavapärasest suuremat varieeruvust terves ja tuumoriga hiires, mis võiks kontrollpeptiidi puhul olla minimaalne. Siinkohal võib pakkuda ühe võimaliku põhjusena taas kord bioloogilisi iseärasusi. Määravaks võib saada hiire vanus, kaal või indutseeritud tuumori suurus ning ka asukoht, sest olles lähemal suurematele veresoontele, võib kasvaja verevahetus olla oluliselt efektiivsem ja areng mõnevõrra kiirem. Kuigi usaldusväärset erinevust ei leitud ühegi peptiidi puhul, siis võib arvata, et suurem katseloomade arv aitaks kinnitada seose olemasolu või puudumist. 29

Mõlema katseskeemi puhul annaks veelgi usaldusväärsemaid tulemusi faagid või nende mutandid, mille elulemus hiire veres oleks pikem. Pikem ringlemine suurendab tõenäosust, et vähispetsiifilised peptiidid jõuavad oma sihtmärgini. Hetkel on optimaalseks veres ringlemise ajaks nude-fox1nu hiirtes 1 tund ja BALB/c hiirte puhul 15 minutit, mille järel on faagi tiiter vereproovis veel võrreldav ja leitav. Sokoloff kolleegidega on kirjeldanud kauaringlevaid faagi T7 sabafiibrimutante, mille kasutamine võiks oluliselt vähendada taustmüra skriiningutel ning anda vähem varieeruvaid tulemusi (Sokoloff jt., 2003). Kokkuvõtvalt omab faagipõhine vähidiagnostiline tehnoloogia endas suurt potentsiaali laiaulatuslikeks sõeluuringuteks. Esimese katseskeemi juures oli näha, et CRGDKGPDC peptiid näitas kõigi 10 katselooma puhul madalamat taset ainult kasvajaga hiirte veres. Ka teine, de novo peptiidide selekteerimiskatse identifitseeris uudseid CendR-järjestusi, kuid usaldusväärsemate andmete saamiseks tuleks katseloomade arvu suurendada. Mõlema kontseptsiooniga tegeletakse edasi ning hetkel on katsejärgus alternatiiv qpcr meetodile, mis võimaldaks määrata mitme erineva biomarkeriga seonduva peptiidi hulka ühes reaktsioonis. Nii saaks kasutada diagnoosimisel korraga mitut vähispetsiifilist või erinevate kasvajatüvedega seonduvaid peptiide. Kui järgnevad katsed kinnitavad meetodi tulemusi, siis kaugemaks eesmärgiks võiks olla analoogne peptiidipõhine diagnostiline sõeluuring nanopartiklitel, kuna vähispetsiifiliste ligandide kinnitamist rutiinselt kasutatavatele nanopartiklitele on praktiseeritud varemgi (Brigger jt., 2012; Davis jt., 2008). Lisaks oleks huvitav näha, kas analoogne meetod on rakendatav ka teist tüüpi tuumoritüvede puhul. Kuna tehnoloogia põhineb tuumorispetsiifiliste peptiidide kvantitatiivsuse määramisel, on võimalus, et lisaks vähi avastamisele on detekteeritav kasvaja arengustaadium või leviku suurus. See jääb siiski väljapoole selle magistritöö eesmärke. 30