NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH MỘT SỐ GIỐNG TẰM DÂU BẰNG KỸ THUẬT RAPD

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH MỘT SỐ GIỐNG TẰM DÂU BẰNG KỸ THUẬT RAPD Nguyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thị Hằng,Nông Văn Hải Viện Công nghệ Sinh học I. MỞ ĐẦU Ngày nay, việc sử dụng các chỉ thị phân tử ADN về đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên- RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn-rflp (Restriction Fragment Length Polymorphism), sự lặp lại các chuỗi đơn giản-ssr (Simple Sequence Repeats) hay còn gọi là tiểu vệ tinh (Microsatellite) để phân loại, nghiên cứu đa dạng sinh học của động vật, thực vật và vi sinh vật ngày càng phổ biến trên thế giới và ở Việt Nam [4, 5, 7, 8]. So sánh với phương pháp truyền thống, phân loại và nghiên cứu đa hình bằng chỉ thị phân tử cho kết quả có độ tin cậy cao [2]. Kỹ thuật RAPD do William và cs, 1990 [8] phát triển trên cơ sở PCR sử dụng một số đoạn mồi ngẫu nhiên. Kỹ thuật này đã được ứng dụng kết hợp cùng với một số kỹ thuật khác để phân loại, nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các cá thể tằm dâu [1, 2, 5, 10,11]. Ở Việt Nam chưa có công trình nào đề cập tới vấn đề này, mặc dù nghề nuôi tằm là một trong những nghề truyền thống của đất nước, hiện đang được đẩy mạnh phát triển, việc phân loại đánh giá đa hình vẫn dựa vào các đặc điểm sinh học và hình thái, cho nên còn có những hạn chế nhất định. Trong bài báo này chúng tôi xin trình bày một số kết quả về sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đa hình một số giống tằm dâu nuôi tại Việt Nam. II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Nguyên liệu Mẫu nghiên cứu gồm tám giống tằm đang được dùng tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam: TTB, TML, VC, ĐS 1, ĐS 2, BM, THT, VYD, trong đó có bốn giống được sử dụng nhiều trong vài năm gần đây, đó là hai giống địa phương thuộc tập đoàn gốc đa hệ: vàng chấm [VC] và Đồ Sơn [ĐS] hai giống tằm lưỡng hệ trắng Thái Bình [TTB] và trắng Mai Lĩnh [TML]. Tất cả các giống tằm trên do Trung Tâm Nghiên cứu Dâu Tằm Tơ Trung Ương, Xí nghiệp Giống Tằm Cấp I Mai Lĩnh và Xí nghiệp Giống tằm Thái Bình cung cấp. Hoá chất : EDTA, Tris-HCl, SDS, Proteaza K, RNaza, chloroform, phenol, NaCl, agaroza của các hãng Sigma, Merck, Amersham Phamacia Biotech, Fermentas...Các loại máy móc chuyên dụng thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen đặt tại Viện Công nghệ Sinh học. 2. Phương pháp nghiên cứu Tách chiết ADN theo Wiliam và cộng sự, tham khảo thêm tài liệu của một số tác giả khác [ 8, 9, 10] và cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Xác định nồng độ ADN bằng phương pháp đo quang phổ, kiểm tra ADN trên gel agaroza 0,8% và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại, chụp ảnh ở máy Geldoc hoặc Polaroid. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR với các đoạn mồi do hãng Genset Singapore Biotech tổng hợp. Tổng thể tích dùng cho một mẫu là 25 µl. Chu trình nhiệt theo tài liệu của Zhou Zheyang và cộng sự [6]. Sản phẩm PCR kiểm tra trên gel agaroza 0,8% và 1,3%. ------------------------------------------------------------------------

Công trình được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí của nhiệm vụ thường xuyên: đề tài cấp Viện Công nghệ Sinh học Phân tích kết quả bằng chương trình phần mềm NTSYS phiên bản 2.0. Hệ số đồng dạng di truyền được tính theo công thức của Nei và Li năm 1979 [3]. III. KẾT QUẢ 1. Tách chiết và làm sạch ADN từ mẫu tằm Mẫu nghiền mịn và hoà tan trong dung dịch đệm, thành tế bào và màng nhân được phá vỡ, giải phóng ADN. Tiếp theo bổ sung proteinaza K để phân huỷ hoàn toàn các protein liên kết. Sau đó, dùng hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol loại bỏ Ảnh 1. Điện di ADN 1-5 : ADN của mẫu. M : ADN λ/ecori+hindiii các tạp chất và ly tâm thu ADN. Loại ARN bằng RNaza ở 37 o C. Sản phẩm ADN được chạy điện di kiểm tra, đánh giá trên gel agaroza 0,8% và đo OD trên máy đo quang phổ, bảng 1 và hình 1 là kết quả thu được. Kết quả cho thấy, sản phẩm nhận được cho vạch gọn và có trọng lượng phân tử lớn hơn 21,6 kb, tỉ lệ OD 260 nm /OD 280 nm dao động từ 1,781 đến 2,025 cho biết ADN thu được có đủ độ sạch để làm nguyên liệu cho PCR hoặc các nghiên cứu tiếp theo. ADN được bảo quản lạnh trong dung dịch TE. Bảng 1. Tỷ số OD 260 nm/od 280 nm và nồng độ của ADN 2. PCR với ADN cuả tằm dâu Chúng tôi đã tìm điều kiện tối ưu cho phản ứng nhân gen đối với các mồi nghiên cứu [6 ], sàng lọc từ 20 đoạn mồi ngẫu nhiên để chọn ra 5 đoạn phù hợp cho tằm. Tiếp theo thực hiện PCR với các giống tằm, kết quả nhận được trình bày ở bảng 2.

Bảng 2: Kết quả RAPD của các giống tằm nghiên cứu [ Cột chỉ thị RAPD: chữ cái và số là ký hiệu của đoạn mồi, tiếp theo là kích thước của băng. Số 1:phân đoạn DNA được nhân. Số 0: phân đoạn ADN không được nhân. Giống tằm 1: TTB, 2: TML, 3: VC, 4: ĐS1, 5:ĐS2, 6: BM, 7: THT, 8: VYD] Các băng nhân bản được sử dụng như là các chỉ thị RAPD bao gồm hai loại đơn hình và đa hình. Băng đơn hình có mặt trong tất cả các giống nghiên cứu, còn băng đa hình xuất hiện ở giống này nhưng lại vắng mặt ở giống khác. Trong tổng số 67 băng nhận được có 26 băng đơn hình, chiếm 38,81% và 41 băng đa hình, chiếm 66,19%, kích cỡ của các băng từ 100bp đến 3500bp. Trong 8 giống tằm nghiên cứu có 2 giống lưỡng hệ tương đối xa nhau về quan hệ di

truyền, còn 6 giống đa hệ địa phương có họ hàng khá gần gũi với nhau, do đó tỷ lệ băng đơn hình ở mức trung bình thấp, tỷ lệ băng đa hình đạt mức trung bình cao hơn. Các băng đa hình là cơ sở phân biệt giữa các giống với nhau, có băng đa hình chỉ xuất hiện ở một giống mà không xuất hiện ở các giống khác như băng 0P019-1200bp và 0P019-1000bp chỉ thấy ở giống TML, băng 0P019-800bp ở giống TTB và trong nhóm đa hệ chỉ xuất hiện ở giống BM. Với mồi 0P016, băng 300bp quan sát thấy ở giống TTB, còn băng 400bp có ở giống TML và duy nhất ở VC trong Hình 2: Sản phẩm PCR mồi OP 13 của các giống tằm nghiên cứu Giếng M: ADN λ/ecori+hindiii Các giếng khác: mẫu của các giống tương ứng. 1-TTB 5-TML 6-VC 8-ĐS 1 9-ĐS 2 10-BM 11- THT 13- VYD nhóm đa hệ. Hiện tượng này còn thấy ở mồi 0P013, băng 550bp ở giống THT, băng 100bp xuất hiện trong giống TML, còn băng 1600bp chỉ thấy ở TTB. Mồi 101, riêng giống TTB có băng 100bp và VC duy nhất mang băng 400bp trong nhóm đa hệ. Băng A7-1300bp, 900bp và 300bp không có ở 7 giống khác mà hiển hiện ở TTB. Giống ĐS1 và ĐS2 cho các băng hệt như nhau trong 4 mồi nghiên cứu, ở mồi thứ 5 chúng có 2 băng phân biệt. So sánh tất cả các mồi sử dụng, mồi 0P016 có tỷ lệ băng đa hình cao nhất 11/12, còn mồi 101 có tỷ lệ đa hình thấp nhất 6/15. Từ các số liệu thu được, chúng tôi phân tích mối tuơng quan di truyền giữa các giống tằm nghiên cứu bằng chương trình phần mềm NTSYS phiên bản 2.0 và trình bày ở bảng 3. Bảng 3. Hệ số đồng dạng di truyền giữa các giống tằm nghiên cứu

Bảng 3 cho thấy, giống TTB có hệ số đồng dạng di truyền dao động trong khoảng 0,547 đến 0,703, thấp nhất trong các giống nghiên cứu, còn ở giống TML chỉ số này cao hơn, biến đổi từ 0,766 đến 0,906. Các giống trong nhóm đa hệ có hệ số đồng dạng di truyền thay đổi từ 0,766 đến 0,984. Giống ĐS1 và ĐS2 có chỉ số cao nhất 0,984, có khả năng đây chỉ là một giống nhưng nuôi ở hai địa phương khác nhau. Từ bảng hệ số đồng dạng di truyền, chúng tôi xây dựng cây phân loại của các giống tằm và biểu diễn bằng hình 3. Dựa trên sơ đồ hình cây biểu thị đa hình ADN giữa 8 giống tằm nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy các giống tằm khảo sát được chia thành hai nhóm lớn, cụm lại ở mức độ 0,54, nhóm thứ nhất chỉ có 1 giống TTB, còn nhóm thứ hai là các giống còn lại, cụm ở mức độ 0,79 và chia thành hai phân nhóm bậc I. Phân nhóm bậc I thứ nhất gồm hai giống TML và VC, cụm lại ở mức 0,90. Phân nhóm bậc I thứ hai là 5 giống thuộc đa hệ và lại chia thành phân nhóm bậc hai... Riêng ĐS1 và ĐS2 ở phân nhóm bậc cao nhất. Hình 1. Cây phát sinh chủng loại của các giống tằm IV. KẾT LUẬN 1. Đã phân tích tính đa dạng di truyền của 8 giống tằm dâu nuôi ở Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD với 5 đoạn mồi, kết quả nhận được 67 băng ADN nhân bản trong đó có 26 (38,8%) băng đơn hình và 41 (61,2%) băng đa hình. Đoạn mồi 0P016 cho số băng đa hình phong phú nhất, mồi 101 có tỷ lệ băng đa hình thấp nhất. 2. Kết quả phân tích NTSYS-SIMUAL cho thấy các giống tằm nghiên cứu có mối tương đồng di truyền trong khoảng 0,547 đến 0,984. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abe H, Kanehara M, Terada T, Ohbayashi F, Shimada T, Kawai S, Suzuki M, Sugasaki T, Oshiki T, 1998. Identification of novel random amplified polymorphic DNAs (RAPDs) on the W chromosome of the domesticated silkworm, Bombyx mori, and the wild silkworm, B. mandarina, and their retrotransposable element-related nucleotide sequences. Genes and Genetic systems,vol 73, No. 4, p. 243-254. 2. Li B, Lu C, Zhou ZY, Xiang ZH, 2000. Construction of silkworm RAPD molecular linkage map. Yi Chuan Xue Bao; 27(2):127-132. 3. Nei M., Li W.H., 1979. Mathematical model for studying genetical variation in terms of restriction endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5269-5273. 4. Nguyễn Văn Đồng và cs, 1999. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phát triển hệ thống lúa lai. Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội. Tr. 1243. 5. Nguyễn Đức Thành, Phan Thị Bảy, Lê Hồng Điệp, 1999. Phát triển và ứng dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng phân tử ở lúa. Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà

Nội. Tr. 1205. 6. Nonnatus S. Bautista, Renando Solis, Osamu Kamijima and Takashige Ishii, 2001. RAPD, RFLP, SSLP analyses of phylogenetic relationships between cultivated and wild species of rice. Genes and Genetic systems,vol 76, No. 2, p. 71-79. 7. Zhou Zheyang et al, 1996. On the relationship between the number of RAPD loci and the information of molecular variation. International Symposium on Sericulturral Science. P. 79-82. 8. William J.G.K., Kubelik, K.J. Livak, J.A.F. Rafalski and S.V. Tingey, 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucle Acids Res. 18: 6531-6535. 9. Juan Carlos Parejo, José Angel Padilla, Araceli Rabasco, M Esther Scasinforiano, Margarita Martínez-Trancón, 2002. Population structure in the endangered Blanca Cacerena bovine breed demonstrated by RAPD analyses. Genes and Genetic systems,vol 77, No. 1, p. 51-57. 10. Joseph Sambrook, David W. Russell, 2001. Molecular cloning, third edition, vol. 2. 11. Xia Quingyou et al, 1996. Study on the molecular genetic diversity of Bombyx mori. International symposium on sericulturral science. p. 76-79. SUMMARY STUDY ON GENETIC DIVERSITY OF SILKWORM STRAINS IN VIETNAM BY RAPD MARKERS Nguyen Thi Thanh Binh, Hoang Thi Hang, Nong Van Hai Institute of Biotechnology The random amplified polymorphic DNA (RAPD) based on the polymeraze chain reaction (PCR) detects nucleotide sequence polymorphism in a DNA amplification based assay using a single 10-mer of arbitrary nucleotide sequence. The RAPD technology has quickly gained widespread acceptance and application because it has provide a tool for genetic analysis in biological system that have not previously benefited the use of molecular markers such as Bombyx mori L. In this study, the genetic diversity of eight silkworm strains were investigated using the RAPD method. The genomic DNA extracted from individuals of every strains by method of Wiliam J. G K, Kubelik K. J, Livak J. A. F, Rafalski and S.V.Tingey. Five RAPD 10-mer primers were used to amplify random sequence from the genomic DNAs of research silkworm strains. These primers generated total 67 bands out of which 41 bands (61,2%) were polymorphic and 26 bands (38,8%) were monomorphic with a mean of 13,4 bands per primer. The highest number of polymorphic bands was observed for primer 0P016-11/12, the primer 101 has a lower polymorphic ratio-6 /15. Difference of RAPD among strains showed that these polymorphisms were strain-specific in Bombyx mori L. For example: the bands 0P0 19-1200 bp and 1000 bp were found to be unique to strain TML, band 0P0 19 800 bp- strain TTB, VC, band 0P0 13 550 bp- TTB. These bands A 7-1300 bp, 900 bp, 300 bp weren t found from another 7 strains but appear on strain TTB. RAPD data were used to generate simple matching coefficients of similarity (SM). The SM then used to constract a phylogenetic dendrogram by the NTSY Spc version 2.0 software. The coefficients of genetic similarity of silkworm strains changed from 0,547 to 0,984. Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Đinh Duy Kháng.