Aplikacije pretočne citometrije April, 2008 polona.bedina@ki.si
Flow cytometry-pretočna citometrija - Merjenje karakteristik celic v tekočini - Podobnost s fluorescenčno mikroskopijo - Analiza kompleksnih celičnih populacij - Sortiranje
Altra
Princip pretočne citometrije
Merilna komora - Flow Cell Izotonična tekočina Fluorescenčni signali Laserski žarek Purdue University Cytometry Laboratories
Forward Angle Light Scatter Laser FALS Sensor Purdue University Cytometry Laboratories
Side Scatter Laser FALS Sensor 90LS Sensor Purdue University Cytometry Laboratories
Fluorescence Detectors Laser FALS Sensor Freq Fluorescence Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.) Purdue University Cytometry Laboratories
Aplikacije pretočne citometrije
Primeri uporabe pretočne citometrije - sledenje proteinov imunofluorescenca - analiza krvi - sledenje apoptoze - analiza celic iz tkiv - analiza celičnega cikla - sortiranje
Sledenje proteinov z imunofluorescenco - ugotavljanje specifičnih epitopov na proteinu (npr. aktivost kinaz z uporabo fosfo-specifičnih protiteles)
Interakcije med proteini
Analiza krvnih celic Scale 1000 200 100 50 40 30 20 15 8 Forward scatter 0 200 400 600 800 1000 Neutrofilci Limfociti Monociti 0 200 400 600 800 1000 Side Scatter Purdue University Cytometry Laboratories
Določanje koncentracije neutrofilcev v krvi Neutrofilci so označeni s specifičnimi primarnimi protitelesi in sek. protitelesi, ki imajo vezan FITC. (undergoing review - Škrajnar Š, Lasnik MA, and Zavec AB: A flow cytometric method for rapid determination of blood neutrophil concentration in rats.)
Apoptoza, merjena z Aneksinom V in PI V601_ PI_Alexa DOX_V601_PI_Alexa (Smilovič V, Zavec AB)
Apoptoza, merjena s spremembo membranskega potenciala mitohondrijev DePsipher Kit: detekcija membranskega potenciala M (kationsko barvilo prehaja v M in sveti rdeče kot multimera; če M potencial pade, barvilo ostane v citoplazmi v monomerni zeleni obliki. Odrasle živali Mladički (Erman A, Zavec AB)
Količina mitohondrijev v regeneracijskem tkivu Analiza iz tkivnih c.: tripsin, kolagenaza MitoTracker Green: se veže na M v živih in fiksiranih c. (Goršič M, Zavec AB)
Analiza celičnega cikla G 2 M G 0 Analiza DNA G 1 s C o u n t G 0 G 1 s G 2 M 0 200 400 600 800 1000 2N 4N DNA content Purdue University Cytometry Laboratories
Sledenje poteka mejotične replikacije DNA-PI (Zavec AB, Lešnik U, Komel R, and Comino A: The Saccharomyces cerevisiae gene ECM11 is a positive effecter of meiosis; FEMS Microbiol Lett. 2004)
Celični cikel in poliploidnost DNA-PI Wt Small Big (undergoing review - Nikitin D, Tosato V, Zavec AB, and Bruschi CV: Cellular and molecular effects of chromosome translocations in Saccharomyces cerevisiae) Val
Sortiranje Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) 488 nm laser FALS senzor detektorji fluorescence nabiti plošči 2000-6000 V - + posamezne celice sortirane v kiveti Purdue University Cytometry Laboratories
Sortiranje EYFP-aktin (Hrovat A, Zavec AB)
Sortiranje Celična linija CHO, transformirana z receptorjem NK1-R(HA), prim.ab rat anti-ha, sekab anti-rat PE. (Hrovat A, Zavec AB)
Prednosti pretočne citometrije visoka občutljivost metode izjemno hitro zaznavanje več parametrov hkrati: velikost, granuliranost, fluorescenca: velika in nesubjektivna statistika največkrat gre za meritve na živih celicah zaznavanje lastnosti posameznih celic: identifikacija celičnih podskupin v kompleksni populaciji
Aplikacije pretočne citometrije April, 2008 polona.bedina@ki.si