Osvetljevanje notranjosti organizmov Steve Wilson Vsako odkritje v zgodovini bioznanosti je prispevalo košček h končnemu razumevanju delovanja organizmov. Posebno velik del k razrešitvi te sestavljanke pa so in bodo tudi v prihodnosti prispevali fluorescentni proteini. Z njihovo pomočjo so številni biološki procesi dobesedno stopili iz teme na svetlo. David Dobnik Zgodba o fluorescentnih proteinih se je začela leta 1960, ko se je japonski raziskovalec Osamu Šimomura pridružil profesorju Franku Johnsonu na univerzi Princeton. Njegov cilj je bil pojasniti molekularne mehanizme bioluminiscentne meduze Aequorea victoria, ki jo lahko najdemo ob zahodnih obalah Severne Amerike. Njena posebnost je, da v vidnem spektru oddaja zeleno svetlobo. Prvi proteinski ekstrakti, pridobljeni iz meduze, so se že na začetku pokazali kot izredno zanimivi za nadaljnje raziskave, zato so potre- bovali večje količine proteinov iz te meduze. Šimomurova skupina je tako naslednjih 19 poletij v zalivu Friday Harbor na tihomorski obali ameriške zvezne države Washington ujela približno 850.000 meduz. Pri delu v laboratoriju so se najprej osredotočili na protein ekvorin, ki so ga identificirali kot aktivno komponento bioluminiscence meduze. Kmalu so začudeni ugotovili, da le-ta oddaja svetlobo modre barve in ne značilno zelene, kot so pričakovali. Da bi razrešili uganko, so Šimomura in sodelavci nadaljevali raziskave ter iz proteinskega ekstrakta izolirali še en protein, ki pa je pokazal močno zeleno fluorescenco. Ta protein so pozneje poimenovali GFP (angl. green fluorescent protein) zeleni fluorescentni protein. Z nadaljnjim raziskovanjem januar 2010 Življenje in tehnika 13
Bioluminiscenca meduze Aequorea victoria (Vir: marbyonline.org) so ugotovili, da oddana modra svetloba ekvorina sovpada z vzbujevalnim spektrom GFP, kar nakazuje, da se oddana svetloba ekvorina porabi za vzbuditev zelene fluorescence v GFP. Eksperimentalni dokaz te hipoteze je Šimomurova ekipa objavila leta 1974. V raziskavah, ki so sledile, so se osredotočili na kemijsko strukturo kromofora GFP. Ker takrat primarna struktura GFP še ni bila poznana, so se dela lotili s klasičnimi biokemijskimi metodami. Z encimom papain, ki razcepi peptidne vezi med aminokislinami v proteinu, so GFP razrezali na manjše koščke, zaradi česar je fluorescenca izginila. Le pri Slovarček pojmov bioluminiscenca v splošnem oddajanje svetlobe pri živih bitjih, ki nastane pri pretvorbi kemične energije v svetlobno fluorescenca fizikalni pojav, pri katerem snov ob vzbuditvi (obsevanjem) s krajšo valovno dolžino svetlobe odda svetlobo z daljšo valovno dolžino fluorescentni protein v tem članku se pojem specifično nanaša na proteine, ki so po strukturi podobni zelenemu fluorescentnemu proteinu iz meduze Aequorea victoria kromofor del molekule, sposoben selektivne absorpcije svetlobe, odgovoren za barvo, ki jo vidimo oz. zaznamo 14 Življenje in tehnika januar 2010 Osamu Šimomura se je rodil leta 1928 v Fukučijami pri Kjotu na Japonskem. Kot otrok je živel dobrih 20 km iz Nagasakija. Pri šestnajstih letih je bil priča eksploziji atomske bombe in kljub močni radioaktivni kontaminaciji je preživel. Leta 1951 je prejel diplomo iz farmacije na Univerzi v Nagasakiju, kjer je naslednja štiri leta delal kot laboratorijski asistent. Leta 1956 se je zaposlil na Univerzi Nagoja in tam leta 1960 doktoriral na področju organske kemije. Njegovo delo je navdušilo profesorja Franka Johnsona, ki ga je nato povabil na univerzo Princeton. Tam se je sprva posvetil delu z bioluminiscentnimi proteini in nato še posebej delu z GFP. Leta 1980 je postal profesor na Univerzi v Bostonu, dve leti pozneje pa se je pridružil še Morskemu biološkemu laboratoriju v kraju Woods Hole, Massachusetts (ZDA). Čeprav je od leta 2001 naprej v pokoju, v kletnem laboratoriju svoje hiše še vedno nadaljuje raziskovalno delo. enem koščku je spekter sprejete in oddane svetlobe ostal enak. Po primerjavi fizikalnokemijskih lastnosti tega koščka s celotnim proteinom se je pokazalo, da so pridobili kromofor GFP in mu pozneje tudi določili kemijsko zgradbo. KLONIRANJE IN IZRAŽANJE GFP Novoodkriti protein bi lahko pomenil pravo revolucijo na področju spremljanja molekularnih procesov v času in prostoru znotraj živih celic. Za takšne raziskave pa je treba poznati gen, ki protein kodira, saj ga le tako lahko vnesemo v druge organizme. Leta 1992 je raziskovalcu Douglasu Prasherju uspelo izolirati in klonirati gen za GFP, vendar pa je bil prepričan, da in vitro proizvedeni protein ne bo fluoresciral, saj mehanizem zvijanja proteina še ni bil poznan. Mislil je, da jim bo uspelo pridobiti le nefluorescentno obliko GFP, ki bi jo uporabili kot reagent za prihodnje biokemijske raziskave kromofora. Zdelo se jim je skrajno neverjetno, da bi se kromofor tvoril spontano, saj so za podobne procese znotraj organizmov potrebni zapleteni encimski sistemi.
Martin Chalfie je gen še isto leto izrazil v bakteriji Escherichia coli in sintetiziran protein je znotraj bakterije oddajal svetlo zeleno svetlobo. Ta rezultat je pokazal, da bi lahko GFP kot označevalec uporabljali v praktično vseh organizmih. Chalfie je gen za GFP vnesel tudi v glisto Caenorhabditis elegans, kjer je bil pod nadzorom promotorja gena za β-tubulin. Glista je uspešno izražala GFP v določenih delih in stopnjah razvoja, in sicer takrat, ko je bil promotor aktiven. Tako so uspešno pokazali, da se lahko GFP uporablja kot označevalni gen ter obenem tudi kot pripomoček za spremljanje lokacije in interakcije proteinov znotraj živih celic. Pozneje so različne skupine ugotovile, da se lahko GFP izraža še v kvasovkah, sesalčjih celicah in vinski mušici. Kljub vsemu pa je mehanizem tvorbe funkcionalnega kromofora v GFP ostajal nepojasnjen. STRUKTURA IN RAZVOJ GFP relativna fluorescenca [arbitarne enote] 1400 1200 1000 800 600 400 200 Model sodčkaste strukture GFP; na levi je pogled od zgoraj in s kromoforom na sredini, na desni pa pogled od strani. (Vir: wikimedia commons in scholarpedia) 0 vzbujanje oddajanje 300 350 400 450 500 550 600 valovna dolžina [nm] Spektralne lastnosti GFP iz meduze Aequorea victoria; spekter vzbujevalne svetlobe je prikazan z vijoličasto, spekter oddane svetlobe pa z zeleno barvo. Iz spektra lahko vidimo, da obsevanje (vzbujevanje) GFP z UV- ali modro svetlobo povzroči, da GFP oddaja (fluorescira) zeleno svetlobo. (Vir: K. Siemering) Kristalna zgradba GFP je bila določena leta 1996. GFP je sestavljen iz 238 aminokislinskih ostankov, pri čemer ostanki na mestih 65 67 (serin-tirozin-glicin) v zaporedju GFP tvorijo fluorescentni kromofor. Protein je sodčkaste oblike in s kromoforom na sredini te strukture. Maksimum vzbujevalnega spektra je pri 400 nm valovne dolžine svetlobe, z drugim vrhom pri 470 nm. Oster vrh oddane svetlobe je pri 505 nm valovne dolžine svetlobe (zelena fluorescenca). Ko je Roger Y. Tsien poskušal GFP izraziti v bakteriji E. coli še v anaerobnih pogojih, je ugotovil, da GFP, tvorjen v razmerah brez kisika, ne fluorescira. Po dodatku kisika pa se je fluorescenca počasi spet pojavila. Na osnovi tega so raziskovalci sklepali, da se funkcionalni kromofor tvori, ko je protein že pravilno zvit, za njegovo tvorbo pa je kot edini dejavnik potreben kisik. Tsien in sodelavci so šli še korak naprej in v genu za GFP na določenih mestih z mutacijami spremenil aminokislinsko zaporedje. S tem jim je uspelo spremeniti spektralne lastnosti proteina, kar pome- januar 2010 Življenje in tehnika 15
Nobelova nagrada za kemijo leta 2008 Roger Y. Tsien, Martin Chalfie in Osamu Šimomura so za svoje delo z GFP leta 2008 prejeli Nobelovo nagrado za kemijo. Od odkritja naprej je ta protein postajal eno izmed najpomembnejših orodij sodobne bioznanosti. S pomočjo GFP so raziskovalci razvili metode za spremljanje procesov, ki so bili prej nevidni, kot npr. za razvoj živčnih celic ali za opazovanje premikanja molekul znotraj celice. Spremljanje proteinov v njihovem naravnem okolju omogoča nov vpogled v kemijske procese v živih organizmih, kar je še posebno pomembno pri raziskovanju nastanka in razvoja bolezni. Nobelovi nagrajenci leta 2008 za kemijo (od leve proti desni): Roger Y. Tsien, Osamu Šimomura in Martin Chalfie (Foto: Reuters) UPORABA FLUORESCENTNIH PROTEINOV Spekter uporabe fluorescentnih proteinov je izredno širok. Omogočajo namreč časovno in prostorsko spremljanje številnih procesov v živih celicah in organizmih, kot so izražanje genov, dinamika in lokalizacija proteinov, interakcije proteinov, podvojevanje in organizacija kromosomov, znotrajcelične transportne poti ter drugi podobni procesi. Poleg tega so iz fluorescentnih proteinov razvili senzorje, ki pokažejo ph-vrednosti, koncentracijo kalcijevih ionov in številne druge pomembne lastnosti notranjosti celic. Vse to pa ne bi bilo mogoče, če ne bi bile razvite metode transformacije oz. genskega spreminjanja živih organizmov, saj lahko fluorescentne proteine vnesemo v celice le na ta način. Kot praktičen primer njihove uporabe si oglejmo spremljanje lokalizacije proteinov. V živih celicah so proteini načeloma nevidni, vidni pa lahko postanejo, če jih na nek način označimo. Če želimo biti res prepričani, da smo označili le želeni protein, je najbolje pripraviti genski konstrukt z genom izbranega ni, da so se vzbujevalni spektri in spektri oddane svetlobe premaknili. Tako so pridobili več različic GFP, ki niso več oddajale samo zelene fluorescence, ampak tudi rumeno, rdečo ali oranžno; prav tako se je izboljšala intenziteta fluorescence in zvijanje proteina ob njegovem nastajanju. Ob koncu prejšnjega stoletja je bil iz koral vrste Discosoma izoliran fluorescentni protein DsRed, ki v vzbujenem stanju oddaja rdečo svetlobo. Skupina Rogerja Tsiena je tudi ta protein okarakterizirala in ga z vpeljavo različnih mutacij izboljšala ter podobno kot pri GFP pripravila različice z različnimi spektralnimi lastnostmi. Različne fluorescentne proteine so izolirali tudi iz drugih nebioluminiscentnih vrst koral (Anemonia sp., Zoanthus sp.). Vsi ti proteini so po spektralnih lastnostih zelo podobni prej omenjenim različnim oblikam GFP. 16 Življenje in tehnika januar 2010 V zgornjem delu slike so suspenzije različnih fluorescentnih proteinov v epruvetkah, spodnja slika pa je narisana z bakterijami, ki izražajo različne fluorescentne proteine. (Foto: R. Tsien)
Shematska predstavitev vizualizacije nativnega proteina β-aktin v sesalčji celici s pomočjo fluorescentnega proteina Gen za fluorescentni protein, združen z genom za β-aktin, se vstavi v jedro celice (a). Gen se prepiše v mrnk (b) in prevede v protein (c). Nativni protein se prestavi na njegovo običajno mesto v celici, na kar fluorescentni protein ne vpliva (d). V primeru β-aktina se le-ta sestavi v filamente znotraj celice (e). V spodnjem desnem kotu je prikazan praktičen primer fluorescentno označenega β-aktina. (Vir: scholarpedia.org) proteina, ki ga povežemo z genom za fluorescentni protein. Ta konstrukt nato prenesemo v celico s transformacijo. Ob uspešnem izražanju vnesenega konstrukta dobimo znotraj celice izbran protein, na katerega je pripet še fluorescentni protein, kar nam omogoča spremljanje lokacije in delovanja vnesenega konstrukta. Še ena izjemna lastnost fluorescentnih proteinov je, da ne motijo delovanja nativnega proteina znotraj celice in tudi ne spreminjajo njegove lokacije znotraj celice označeni protein tako v celici neovirano opravlja svojo običajno vlogo. Za spremljanje fluorescentnih proteinov potrebujemo fluorescentni mikroskop, da izberemo točno valovno dolžino svetlobe, s katero želimo vzbuditi fluorescenco proteina, ki ga želimo spremljati. Zelo izpopolnjena oblika takega mikroskopa je konfokalni mikroskop. Z njim lahko izberemo valovno dolžino svetlobe, s katero vzbudimo fluorescenco fluorescentnega proteina, prav tako pa izberemo območje spektra, v katerem bomo spremljali oddano fluorescenco. To je zelo pomembno, kadar v celici poleg vnesenega fluorescentnega proteina naravno fluorescira še kaj drugega. Prav tako lahko hkrati spremljano dogajanje pri več valovnih dolžinah in slike pozneje združimo. Konfokalni mikroskop omogoča opazovanje tudi v tretji ravnini, kar pozneje omogoča 3-dimenzionalne rekonstrukcije opazovanega objekta. Tako lahko povsem neinvazivno spremljamo fluorescentno označene nativne proteine znotraj živih celic. Dobljene slike nam pokažejo točno lokacijo označenega proteina. Z opisano metodo lahko v teoriji spremljamo lokacijo katerega koli proteina, če je le poznano zaporedje gena, ki ga kodira. S konfokalnim mikroskopom narejena slika kaže korenino gensko spremenjenega navadnega repnjakovca, pri katerem je fluorescentni protein združen s proteini, ki so v jedru celice. Celične stene so bile kemijsko obarvane, da fluorescirajo rdeče. (Foto: John Runions) januar 2010 Življenje in tehnika 17
določenih procesov, v katere so vpleteni posamezni proteini. Spremljanje teh procesov s pomočjo fluorescentnih proteinov na modelnih organizmih (npr. miših) nam lahko ponudi nov vpogled v celoten sistem ne le razvoja bolezni, temveč delovanja organizma na splošno. Tudi na Nacionalnem inštitutu za biologijo v Ljubljani uporabljamo fluorescentne proteine za sledenje vnosa genov v rastlinske celice. (Foto: David Dobnik) Področje raziskav fluorescentnih proteinov je potekalo od lovljenja velikanskega števila meduz do gensko spremenjenih živali, ki se svetijo pod ultravijolično ali modro lučjo. Naj se sliši še tako nesmiselno, ampak prav takšne živali pomenijo začetek raziskav nastanka in razvoja bolezni. Vzroki za nastanek bolezni so velikokrat napake ali nedelovanje Literatura 1. The Royal Swedish Academy of Sciences, Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry 2008, The green fluorescent protein: discovery, expression and development. 2008. 2. Shaner s sod., Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology, 2004. http://... learn.hamamatsu.com/galleries/digitalvideo/index.html (videoposnetki fluorescentnih proteinov znotraj živih celic) en.wikipedia.org/wiki/green_fluorescent_protein (o zelenem fluorescentnem proteinu) nobelprize.org (Nobelova fundacija) www.plantsci.cam.ac.uk/haseloff/imaging/index_imaging.htm (optična mikroskopija in fluorescenca) 18 Življenje in tehnika januar 2010