Mikroskopija s Försterjevim resonančnim prenosom energije

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA MATEMATIKO IN FIZIKO Mikroskopija s Försterjevim resonančnim prenosom energije Seminar v 3. letniku Avtorica: Anja Horvat Mentor: dr. Zoran Arsov Ljubljana, Povzetek V seminarju bomo predstavili mikroskopijo s Försterjevim resonančnim prenosom energije (FRET). Gre za različico fluorescenčne mikroskopije, ki se uporablja za določanje razdalj med dvema molekulama barvil na tipično nanometrski skali. Na začetku bom predstavila pojav fluorescence in njeno uporabo v mikroskopiji. V drugem delu seminarja bo opisan proces Försterjevega resonančnega prenosa energije in štiri različne mikroskopske metode za zaznavanje učinka FRET. Podrobneje bom opisala metodo za določanje FRET na osnovi spektralne analize s fluorescenčno mikrospektroskopijo. Prednosti te metode bom predstavila tudi z opisom eksperimenta, pri katerem smo spremljali interakcijo nanodelcev z lipidno membrano.

2 Kazalo 1 UVO...1 FLUORESCENCA....1 OSNOVE FLUORESCENCE....3 FLUORESCENČNI MIKROSKOP KONFOKALNA MIKROSKOPIJA MIKROSKOPIJA S FÖSTERJEVIM RESONANČNIM PRENOSOM ENERGIJE (FRET) FÖSTERJEV RESONANČNI PRENOS ENERGIJE (FRET) PRISTOPI K FRET MIKROSKOPIJI Intenziteta emisije akceptorja Fluorescenčna mikroskopija življenjske dobe (FLIM) Bledenje fluorescence FLUORESCENČNA MIKROSPEKTROSKOPIJA (FMS) RAZISKAVA INTERAKCIJE NANOELCEV Z VOSLOJNIMI LIPINIMI MEMBRANAMI ZAKLJUČEK VIRI Uvod Opazovanje stvari, ki so prostemu očesu nevidne, že od nekdaj spodbuja razvoj znanosti in tehnologije. V 17. stoletju izumljen prvi optični mikroskop nam je omogočil videti prej nedoumljive gradnike našega telesa in narave okoli nas. Ena izmed omejitev optičnega mikroskopa je ločljivost d, ki jo definiramo kot razdaljo, pri kateri dva točkasta svetlobna izvora še lahko razločimo, in je odvisna od valovne dolžine svetlobe λ in numerične aperture objektiva NA kot: d NA, (.1) Pri npr. valovni dolžini 550 nm in numerični aperturi 1.5 za oljni imerzijski objektiv, dobimo ločljivost okoli 00 nm. To je na primer dovolj za opazovanje celic, vendar še zdaleč ne zadošča za lokalizacijo procesov na molekulskem nivoju, ki v njih potekajo. V začetkih 0. stoletja se je začela revolucija v svetu svetobnih mikroskopov. Med letoma 1911 in 1913 sta Otto Heimstaedt in Heinrich Lehmann ustvarila prvi fluorescenčni mikroskop, v zadnjih nekaj desetletjih pa je začela fluorescenčna mikroskopija dobivati svoj pravi pomen. Njen razvoj je v teh letih odprl pot do številnih novih dognanj, predvsem v svetu bioloških znanosti, saj nam omogoča pogled v svet živih celic in opazovanje krajevnih spremenljivk v mikrometrski ločljivosti. Fluorescenčna mikroskopija se je v teh letih močno razvila in postala osnova za mnoge metode opazovanja fluorescence. Ena izmed njih je tudi mikroskopija FRET, katere osnovo je v 40. letih 0. stoletja postavil Teodor Förster. Pomembnost tega 1

3 odkritja se je dodobra pokazala šele v zadnjih dvajsetih letih z razvojem različnih tehnik in aplikacijo v bioloških sistemih. Z uporabo primernih fluorescenčnih barvil, naprednih optičnih sistemov, detektorjev in analitičnih orodij omogoča FRET študije interakcij in kolokolizacije molekul z majhno medsebojno razdaljo in je kot taka ena izmed osnovnih tehnik za opazovanje celičnih procesov. Fluorescenca Snov v vzbujenem stanju lahko v osnovno stanje preide bodisi s katerim izmed nesevalnih procesov bodisi s pojavom luminiscence, torej oddajanjem fotonov. Luminiscenco lahko delimo na dve kategoriji: fluorescenco in fosforescenco, ki ju ločimo po naravi vzbujenega stanja. Pri fluorescenci je vzbujen elektron v stanju s spinom, ki je nasproten smeri spina njegovega para v osnovnem stanju, zato je prehod dovoljen in se zato zgodi nemudoma. Fosforescenca se od fluorescence razlikuje le po tem, da ima elektron v vzbujenem stanju enako smer spina kot njegov par v osnovnem stanju. Prehod je tako zaradi simetrije prepovedan in zato počasnejši (slika 1)..1 Osnove fluorescence Prehode med različnimi energijskimi stanji najbolje prikažemo z diagramom Jablonskega (slika 1). Vpadni foton povzroči prehod elektrona iz osnovnega v višje vzbujeno stanje, za kar potrebuje energijo: E f Evzb Eosn h, (.1) kjer sta je ν frekvenca vpadnega fotona in h Planckova konstanta. Elektron se ob prehodu lahko znajde tudi v vzbujenem nihajnem stanju. To stanje zanj ni energetsko ugodno, zato se vibracijsko relaksira v najnižje nihajno stanje znotraj elektronskega vzbujenega stanja (slika 1), pri čemer razliko energij odda okolici v obliki toplote. Ker elektron pred prehodom nazaj v osnovno stanje vedno preide v vzbujeno stanje z najnižjo energijo, je spekter izsevane svetlobe praviloma neodvisen od valovne dolžine vpadnega eksitacijskega valovanja.

4 Slika 1 iagram Jablonskega predstavlja pri fluorescenci udeležene energijske prehode med elektronskimi in vibracijskimi stanji. Modri puščici predstavljata ekcitacijo pri absorpciji fotona, oranžne vijugaste neradiacijsko neemisijsko izgubo energije (IC notranja konverzija; quenching dušenje), rdeče fluorescenčno emisijo. Slika prikazuje tudi proces fosforescence, in sicer vijolična vijuga prehod elektrona v vzbujeno tripletno stanje in nato zelena črta fosforescenco. Iz časov, označenih na diagramu, je razvidno, da je fosforescenca mnogo daljši proces od fluorescence. Elektron se iz vzbujenega stanja vrne nazaj v eno izmed vibracijskih osnovnih stanje z oddajanjem kvanta energije v obliki izsevanega fotona. Praviloma je vrsta prehoda v obeh smereh enaka, zato sta absorpcijski (eksitacijski) in emisijski spekter elektromagnetnega valovanja skoraj zrcalna (slika ). Slika Shematski prikaz absorpcijskega in emisijskega spektra ter Stokesovega premika. Zaradi prej omenjene izgube energije pri vibracijski relaksaciji ob prehodu elektrona iz višjega v nižje vzbujeno stanje, je valovna dolžina emitiranega fotona daljša od valovne dolžine vzbujalnega fotona. Razliko v spektralnih maksimumih vzbujevalne in emitirane imenujemo Stokesov premik (slika ), katerega vrednost variira glede na fluorescenčno barvilo. Elektron lahko iz vzbujenega stanja preide v osnovno stanje tudi brez oddajanja svetlobe, če odvečno energijo molekula izgubi pri trkih z okoliškimi molekulami, kar 3

5 imenujemo dušenje fluorescence (ang. quenching) (slika 1) ). Pri tem se zmanjša njen kvantni izkoristek, ki je definiran kot: število izsevanih fotonov število absorbiranih fotonov. (.) Kvantni izkoristek je občutljiv na spremembe v ph, polarizacijo topila, koncentracijo fluorescenčnih barvil in prisotnost molekul, ki na vzbujeno stanje vplivajo..3 Fluorescenčni mikroskop Temelj večine fluorescenčnih mikroskopov za celično-biološke raziskave je obrnjen svetlobni mikroskop, saj je opazovanje vzorcev v suspenziji oziroma raztopini s spodnje strani precej olajšano. Za osvetlitevv uporabljamo različne vire. Starejši način so živosrebni in ksenonski svetlobni izvori, s katerimi lahko osvetljujemo večino opazovanih fluorescenčnih barvil. Širok spekter svetlobe teh virov svetlobe moramo za uporaboo v fluorescenčnem mikroskopu omejiti na manjše spektralno okno, pri čemer si pomagamo z vzbujevalnim filtrom (slika 3). Ker za uspešno vzbujanje praviloma potrebujemo visoko intenzivno svetlobo, so se za dober nadomestek izkazali laserji. Z njimi dobimo dovolj visoko intenziteto svetlobe, vendar pa za vzbujanje različnih fluorescenčnih barvil potrebujem več različnih laserjev, saj njihov spekter ni tako širok kot pri živosrebrnih in ksenonskih virih svetlobe. Vzbujevalnih filtrov pri tem načinu ne potrebujemo, še vedno pa ostajajoo del mikroskopa emisijski filtri, ki zaustavijo svetlobo vzbujevalnih valovnih dolžin in prepustijo le del spektra, kjer pričakujemo fluorescenco (slika 3). Vzbujevalno in emitirano svetlobo, ki potujeta po isti optični poti, ločimoo z dikroičnim zrcalom, ki proti detektorju prepusti le fluorescenčni signal barvila (slika 3) ). etekcija svetlobe na sodobnih fluorescenčnih mikroskopih poteka s pomočjo digitalnih (CC) kamer, kjer se glede na nameravano uporabo odločamo med modeli z visoko krajevno ločljivostjo, hitrostjo branjaa ali občutljivostjo. A B Slika 3 (A) Prikaz zgradbe fluorescenčnega mikroskopa s širokospektralnim izvorom: z ekscitacijskim filtrom izberemo del spektra, ki je primeren za obsevano barvilo, in ga z dvobarvnim zrcalom pošljemo proti vzorcu. ikroično zrcalo prepušča emitirano svetlobo iz vzorca proti detektorju, emisijski filter pa zadrži neželene prispevke drugih valovnih dolžin. (B) Graf prepustnosti ekscitacijskega (modra črta) in emisijskega filtra (zelena črta) ter dvobarvnega zrcalaa (siva črta). 4

6 .4 Konfokalna mikroskopija Pri opazovanju fluorescenčnega vzorca nas pogosto ovira prepuščena fluorescenca opazovanega barvila, ki izvira iz ravnin vzorca izven goriščne ravnine. Temu problemu se lahko izognemo z uporabo konfokalne mikroskopije. Konfokalen mikroskop temelji na prehodu svetlobe skozi dve drobni luknjici, ki se nahajata v ustreznih goriščnih ravninah glede na vzorec. Prva luknjica zbere žarke vzbujevalne svetlobe v opazovani goriščni ravnini vzorca, zato je tam jakost vzbujanja mnogo večja kot v okoliških ravninah. Kljub fokusiranemu vzbujanju lahko fluorescenca iz okoliških ravnin močno zamegli sliko, zato je na strani, kamor potuje emitirana svetloba, še en zaslon z luknjico, kamor se zbirajo zgolj žarki iz ravnine, ki nas zanimajo (slika 4). Velikosti luknjic določata globinsko ostrino sistema, pri čemer manjša luknjica pomeni večjo ločljivost, seveda do meje, ki jo določa uklon svetlobe. Hkrati manjša luknjica pomeni manj prepuščene svetlobe, zato je učinkovito zaznavanje preostale fluorescenčne svetlobe še posebej pomembno. Z opisanim postopkom zajamemo sliko zgolj iz ene same točke vzorca, ki jo določata legi luknjic, zato moramo za zajem celotne slike žarek po vzorcu ustrezno premikati. Sistemi z laserskim osvetljevanjem praviloma uporabljajo način vrstičnega vzorčenja signala (angl. laser scanning confocal microscopy), medtem ko se v kombinaciji s širokospektralnimi izvori navadno uporablja hitro vrteči disk z velikim številom luknjic, razporejenih v spiralo (angl. spinning/nipkow disk). Pri tem načinu naenkrat zajamemo celotno sliko, saj veliko število luknjic efektivno deluje tako, kot bi signal hkrati vzorčili z velikim številom žarkov. Slika 4 Z uporabo dveh zaslonov z luknjicami konfokalni mikroskopi uspešno zavirajo svetlobo iz izvengoriščnih ravnin. 3 Mikroskopija s Fösterjevim resonančnim prenosom energije (FRET) Pojav resonančnega prenosa energije, ki ga je prvi opisal Teodor Förster, nam predstavlja veliko priložnost za pridobivanje pomembnih podatkov o razdaljah med molekulami, njihovih orientacijah in njihovi dinamiki s pomočjo konvencionalnih 5

7 fluorescenčnih mikroskopov. V zadnjih 10 letih se je mikroskopija s Försterjevim (oziroma fluorescenčnim) resonančnim prenosom energijee FRET ustalila kot eden izmed osnovnih načinov za opazovanje celic, njihovih struktur in znotrajceličnih procesov. FRET temelji na neradiacijskem prenosu energije z vzbujenega fluorescenčnega barvila, ki ga imenujemo donor, na bližnjo molekulo v osnovnem stanju, imenovano akceptor, pri čemer slednja ni nujno fluorescenčna. Interakcija poteka na razdalji, manjši od približno 10 nm. Samaa prisotnost FRET signala nam torej podaja informacijo, da sta molekuli na razdalji, manjši od 10 nm, ne glede na optično ločljivost samega mikroskopa, močna krajevna odvisnost intenzitete FRET pa omogoča zelo natančno določitev velikosti razdalje. 3.1 Fösterjev resonančni prenos energije (FRET) Försterjev resonančni prenos energijee poteka preko dipol-dipol interakcije. Za prenos energije je potrebno, da se emisijski spekter donorja prekriva z absorpcijskim spektrom akceptorja ter da sta donor in acceptor zadosti blizu. Prekrivanje emisijskega spektra donorja in absorpcijskega spektra pomeni, da lahko energija, ki jo donor prenese pri prehodu iz vzbujenega stanjaa v osnovnoo stanje, vzbudi akceptor v vzbujeno stanje. Iz pogoja, da se morata ti energiji ujemati, vidimo, da gre za resonančni proces. Za enostavnejšo razlago samega procesa Försterjevega resonančnega prenosa energije privzemimo, da je akceptor na začetku v osnovnem stanju, donor pa s svetlobo vzbujamo. onorjev elektron preide iz osnovnega v eno izmed vzbujenih vibracijskih stanj, čemur nemudoma sledi vibracijska relaksacija (slika 5). onor ostane v vzbujenem stanju z najnižjo energijo. Za resonančni prenos energije mora biti razlika energij osnovnega in najnižjega vzbujenega stanja donorja enaka razliki energij osnovnega in enega izmed vzbujenih stanj akceptorja (slika 5). Slika 5 iagram Jablonskega prikazuje resonančni prenos energije. Iz diagrama je razvidno, da koraki pred samim prenosom energije (absorpcija, vibracijska relaksacija) trajajo mnogo manj od procesa fluorescenčne emisije ali FRET. Čas, ki ga fluorescentno barvilo preživi v vzbujenem stanju, imenujemo življenjski čas fluorescence. 6

8 Če so vsi pogoji izpolnjeni, lahko z dipol-dipol interakcijo dolgega dosega poteče Försterjev prenos energije z donorja () na akceptor (A). Molekuli donorja in akceptorja sta šibko sklopljeni, zato lahko napišemo Hamiltonian za FRET v obliki, ki jo lahko rešimo s perturbacijsko teorijo: H H V 0 H0 * A H * A A* HA A* (.3) Pri tem je H Hamiltonian sistema z vzbujenim donorjem in H A Hamiltonian sistema z vzbujenim akceptorjem. V enačbi (3.1) označujemo elektronsko in jedrsko konfiguracijo donorske molekule v osnovnem stanju z, akceptorske molekule v osnovnem stanju z A, donorsko oziroma akceptorsko molekulo v vzbujenem stanju pa z * oziroma A* v tem zaporedju. ipol-dipol interakcijo med obema molekulama lahko zapišemo v obliki potenciala: V 1 3( ˆ)( ˆ A r r) A (.4) 3 4 r 0 kjer je r razdalja med donorjem in akceptorjem ter ˆr enotski vektor, ki kaže smer med njima. Pri tem predpostavimo, da so dipolni operatorji v enačbi neodvisni od jedrske konfiguracije in delujejo le na elektronska stanja. To predpostavko imenujemo Condonova aproksimacija. Elementa prehodne matrike operatorjev dipolov A in lahko zapišemo kot: A A* A* A A AA* A* A * * * * (.5) kjer AA *, A * A, * in * predstavljajo diagonalne matrične elemente. Za dipolni operator lahko velikost in smer zapišemo kot A u A A. Iz tega dobimo prehodni matrični element dipolne interakcije: A V * A A* A* * A 3 4 r (.6) 0 pri čemer smo vse orientacijske faktorje združili v κ: 3( uˆ rˆ)( uˆ rˆ) uˆ uˆ (.7) A A Iz enačbe (3.5) je razvidno, da je FRET sklopitev neposredno odvisna od kota med dipoloma obeh sodelujočih molekul. Z uporabo Fermijevega zlatega pravila, zapisanega v obliki korelacijske funkcije interakcije, dobimo stopnjo prenosa energije: 7

9 wet V ( ( t) (0)) 1 VtV () (0) dt (.8) kjer je ( ( t) (0)) gostota stanj. V enačbo (3.6) vstavimo začetno * A in končno stanje sistema A* : 1 1 w dt A* ( t) ( t) (0) (0) * A ET 6 (4 0) r A A (.9) iht/ ih t/ kjer je orientacijski faktor donorja () t e e (podobno za akceptor). Če v enačbo (3.7) vstavimo za µ A in µ njuni vrednosti iz enačb (3.3), vidimo, da delujeta zgolj na ali na, saj le v teh primerih dobimo neničelno rešitev. Izraza za stanji donorja in akceptorja lahko zato ločimo: 1 1 w dt * ( t) (0) * A ( t) (0) A ET 6 A A 4 r dt C * *() t CAA() t r (.10) kjer sta in korelacijski funkciji za donorjevo emisijo in akceptorjevo absorpcijo v tem zaporedju. Korelacijski funkciji lahko z izpeljavo iz Hamiltoniana za premaknjen harmonski oscilator zapišemo kot: i( * s ) tg ( t) * *() * C t e C () t e AA AA* i tg t AA* A (.11) kjer AA * predstavlja akceptorjevo absorpcijsko frekvenco, s pa * * emisijsko frekvenco donorja, ki smo jo izrazili z njegovima absorpcijsko frekvenco * in Stokesovim premikom s. Oznaki g() t in ga() t predstavljata razliki energij ustreznih vzbujenega in osnovnega stanja donorja oziroma akceptorja. ani funkciji lahko inverzno Fourierjevo transformiramo: 1 it C * * t e emisd 1 it A CAA t e abs d (.1) Pri tem sta emis emisijski spekter donorja in A abs absorpcijski spekter akceptorja. Parsivalov teorem, ki pravi, da je integral para dveh funkcij po času enak integralu 8

10 njunih Fourierjevih transformirank po frekvenci, nam omogoča, da izrazimo stopnjo prenosa energije s prekrivnim integralom med spektroma emisije in absorpcije: w 1 1 A ET 6 * AA* abs( ) emis 8 r 0 d (.13) kjer je spektralna krivulja, normalizirana s kvadratom elementa prehodne matrike. Prekrivni integral je mera za resonanco pri prenosu energije med donorjem in akceptorjem. V primeru, da je prekrivni integral ničeln, do prenosa energije ne pride, kot je razvidno iz enačbe (3.11). Fluorescenčni barvili sta takrat nepovezani. Iz enačbe (3.11) je razvidno, da je stopnja prenosa energije obratno sorazmerna z r 6. Pri izpeljavi enačbe (3.11) smo zanemarili zelo pomemben vpliv časa, ki ga donor preživi v vzbujenem stanju, na hitrost prenosa energije. Za izračun te hitrosti vpeljemo konstanti τ, ki označuje življenjski čas donorjeve fluorescence, ter Försterjev radij R 0, ki označuje kritično razdaljo, pri kateri izkoristek prenosa energije od donorja na akceptorja postane 50%. Försterjev radij opisuje enačba: R 4 9 c 6 emis( ) A( ) d 8 n ( ) (.14) kjer so c hitrost svetlobe v vakuumu, n lomni količnik topila, emis emisijski spekter donorja in molarni absorpcijski koeficient akceptorja, ki nam pove, kako dober absorber je akceptor pri določeni frekvenci. Z vpeljavo teh konstant dobimo enačbo za hitrost resonančnega prenosa energije: v ET 6 1 R0 r (.15) Izkoristek prenosa energije po Försterju, imenovan tudi FRET izkoristek E FRET, običajno definiramo kot relativno spremembo donorjeve fluorescenčne emisije: E FRET 1 1 r R 0 6 (.16) Iz enačbe (3.14) lahko enostavno izrazimo razdaljo, ki je potrebna za željen E FRET : 1 r R0 EFRET (.17) Razdalje, pri katerih spremembe lahko detektiramo z zadostno občutljivostjo, so nekje med 3-8 nm, kar ustreza FRET izkoristkom 5%-95%. 9

11 3. Pristopi k FRET mikroskopiji 3..1 Intenziteta emisije akceptorja Spremljanje spreminjanja intenzitete emisije akceptorja v odvisnosti od razdalje je verjetno najenostavnejša metoda za merjenje FRET. Problem, ki se pojavi pri tej metodi, je prekrivanje emisijskih spektrov obeh fluorescenčnih barvil (slika 6), zato je potrebno več kontrolnih meritev. Poleg meritve FRET izmerimo tako še emisijska spektra (i) donorja v odsotnosti akceptorja in (ii) akceptorja v odsotnosti donorja. Ti dve meritvi nam omogočata, da lahko določimo, kolikšen delež emisije v danem delu spektra FRET pripada donorju in kolikšen delež akceptorju. Slika 6 (levo) Graf prikazuje prekrivanje vzbujevalnih spektrov donorja in akceptorja. (desno) Graf prikazuje emisijska spektra donorja in akceptorja ter njuno prekrivanje (angl. crosstalk). Velik napredek v tej smeri predstavlja FRET s spektralnim slikanjem. Pri tej metodi namesto merjenja intenzitet akceptorja in donorja zgolj v okolici max merimo celotna emisijska spektra donorja in akceptorja po ekcitaciji. Merjenje celotnega spektra nam omogoča lažje določanje spektralnih prekrivanj (slika 10) in s tem natančnejše opazovanje učinkovitosti FRET. Spektralna analiza je mogoča s sklapljanjem mikroskopije in spektroskopije, eden izmed možnih načinov te tehnike pa je opisan tudi v nadaljevanju seminarja. 3.. Fluorescenčna mikroskopija življenjske dobe (FLIM) Fluorescenčna mikroskopija življenjske dobe metoda, kjer življenjsko dobo fluorescence, torej karakteristični čas, ki ga elektron preživi v vzbujenem stanju preden se relaksira nazaj v osnovnega. Ta spremenljivka je neodvisna od intenzitete vzbujevalne svetlobe, transmisijskega izkoristka mikroskopa in zmernega bledenja fluorescence, kljub temu pa je občutljiva na spremembe v ph, polarnosti, temperaturi itd., kar nam pomaga pri določanju različnih okolij v vzorcu oziroma živi celici. 10

12 Slika 7 Meritve FLIM potekajoo na dva načina. Graf levo prikazuje časovno meritev, pri katerem se s pulzom svetlobe fluorescenčnoo barvilo vzbudi (zelena), nato življenjsko dobo fluorescence določimo naravnost iz meritev emitirane svetlobe (rdeča). Graf na desni prikazuje frekvenčno meritev, kjer na vzorec pošiljamo sinusni signal svetlobe (zelena), življenjsko dobo fluorescence pa določamo bodisi iz faznega zamika, bodisi iz zmanjšanja amplitude emitirane svetlobe (rdeča). Pri FLIM-FRET pride do izrazaa odvisnost življenjske dobe fluorescencee od energijskega prenosa, saj se čas, ki ga elektron preživi v vzbujenem stanju, manjša s približevanjem akceptorjaa (slika 8) ). Kadar pride do energijskega prenosa lahko namreč donorska molekula iz vzbujenega stanja v osnovnega pride poleg s fluorescenčno emisijo tudi z oddajanjem energije, zato se življenjska doba fluorescence statistično zmanjša (slika 5). S to metodo lahko merimo dinamiko sistema, prostorsko porazdelitev biomolekularnih koncentracij, interakcije med biomolekulami in konformacijske spremembe z večjo natančnostjo kot s konvencionalnimi metodami FRET. Energijski izkoristek FRET (E FRET ) lahko izračunamo kot: E FRET A 1 (.18) kjer sta τ A in τ A življenjska časa odsotnosti akceptorja. donorjeve fluorescence v prisotnosti oziroma Slika 8 Graf prikazuje odvisnost življenjske dobe donorjeve fluorescence od razdalje med donorjem in akceptorjem, pri čemer polna črta velja za donor v odsotnosti akceptorja. 11

13 3..3 Bledenje fluorescence Bledenje signala fluorescence je pojav, pri katerem se zaradi obsevanja s svetlobo pri molekuli trajno zmanjša ali onemogoči proces vzbujanja in relaksacije z emisijo svetlobe. Fluorescenčna barvila so na ta pojav občutljiva v svojem vzbujenem stanju, zato kažejo tista z daljšo življenjsko dobo višje stopnje bledenja. Resonančni prenos energije direktno zmanjšuje življenjsko dobo fluorescence, bledenje fluorescence pa je obratno sorazmerno s življenjskim časom fluorescence, zato lahko izračunamo FRET iz primerjave stopenj bledenja donorja v prisotnosti in odsotnosti akceptorja (akceptor popolnoma zbledimo). V tipičnem eksperimentu z uporabo bledenja fluorescence v omejenem prostoru izmerimo intenziteto fluorescence donorskega fluorescenčnega barvila pred (I A ) in po bledenju (I ) akceptorja. Razlika med tema dvema meritvama nam omogoča direkten izračun izkoristka FRET: E FRET IA I IA 1 (.19) I I Če FRET poteče, se donorjeva intenziteta na območju bledenja poveča. 3.3 Fluorescenčna mikrospektroskopija (FMS) Metoda za merjenje učinkovitosti FRET, s katero sem se tekom pisanja seminarja spoznala tudi sama, je fluorescenčna mikrospektroskopija (FMS). FMS združuje dve pomembni tehniki fluorescenčno mikroskopijo in spektroskopijo. Klasična fluorescenčna mikroskopija praviloma meri zgolj intenziteto same svetlobe, kjer absolutne vrednosti niso točno določene, zdužena s spektroskopijo pa nam omogoča natančno določitev lege spektralnih vrhov ter posledično krajevno in časovno spremljanje molekularnih procesov v celicah in modelnih sistemih. Mikroskop, uporabljen na v naslednjem poglavju opisanih meritvah, temelji na klasičnem konfokalnem fluorescenčnem mikroskopu s ksenonskim izvorom kot virom širokega spektra svetlobe. Glavna razlika med mikrospektroskopom in klasičnim mikroskopom je nastavljivi tekočekristalni filter (LCTF), ki nam omogoča zaporedno zajemanje slik pri različnih valovnih dolžinah. Z naključnim vzorčenjem valovnih dolžin zmanjšamo bledenje fluorescence. Uspešno obvladovanje bledenja nam omogoča tudi krajevno ločljivo spremljanje pojemanja signala, ki nam razkriva fizikalno-kemijske lastnosti okolice fluorescenčnih barvil, s čimer uporabnost FMS še razširimo. Standarden čas zajema optične rezine na takem fluorescenčnem mikrospektroskopu je reda velikosti nekaj deset sekund. Pridobljene slike iz meritve lahko še dodatno računalniško kontrastiramo tako, da bolje razločimo spektralne razlike med različnimi deli slike. Vsako točko slike npr. barvno kodiramo tako, da barvni odtenek odraža vrednost spremenljivke, npr. valovno dolžino maksimuma emisijskega spektra ali intenziteto spektra, v tisti točki. 1

14 4 Raziskava interakcije nanodelcev z dvoslojnimi lipidnimi membranami V sklopu priprave na seminar o mikroskopiji s Försterjevim prenosom energije sem z dr. Majo Garvas na Odseku za trdno snov Instituta Jožef Stefan na kratko sodelovala pri eni izmed njenih raziskav, ki jo opravlja na tamkajšnjem fluorescenčnem mikrospektroskopu. Nanotehnologija dandanes nastopaa na praktično vseh področjih raziskovanja a. V farmaciji se nanodelci začenjajo uporabljati kot nosilci zdravilnih učinkovin. Ko se nanodelci približajo celici, je njihov prvi stik z njo na celični membrani. V raziskavah lahko ta del celice aproksimiramo z lipidnimi membranami velikanskih enoslojnih vesiklov (GUV). GUV za potrebe opisane raziskave so pripravljeni iz lipidov, ki smo jih dodali membranski fluorescenčni označevalec Bodipy z absorpcijoo pri 58 nm in emisijo pri 550 nm. Ti membranski označevalci delujejo kot akceptorji FRET. Nanodelci TiO NT so označeni s fluorescenčnim barvilom Alexa 448 SP, ki absorbira svetlobo pri 448 nm, emitira pa pri približno 50 nm in je v tem primeru donor. Omenjeni fluorescenčni barvili tvorita FRET par. Močno razredčene GUV kanemo na en rob opazovalnegaa stekelca, na drugi rob pa kapljico nanodelcev. Z mikroskopom poiščemo primeren GUV z malo slojev ter brez delcev liposomov v notranjosti, nato previdno zlijemo nanodelce v območje izbranega GUV. Vsakih pet minut zajamemo sliko vzorca, pri čemer spremljamo emitirano svetlobo na intervalu med 510 nm in 580 nm z -nm korakom (slika 9). Visoka intenziteta (A) (B) Nizka intenziteta Slika 9 Prikaz zajema emisijskega spektra fluorescenčnih označevalcev na nanodelcih (A) in fluorescence membranskih označevalcev (B). Ločena spektra fluorescenčnih označevalcev dobimo s pomočjo razstavljanja komponent posameznih označevalcev (slika 10). Po zajemu slik računalniško obdelamo spekter v vsaki točki opazovanja. Na podlagi spektralnih karakteristik opazovanih fluorescenčnih barvil dobimo spremembe posameznih komponent v odvisnostii od časa za vsako točko zajemaa (slika 10). Pri tem ena komponenta ustreza emisijskemu spektru membranskega fluorescenčnega označevalca (slika 10C, modra črta),, druga pa emisijskemu spektru fluorescenčnega označevalca na nanodelcih (slika 10C, rdeča črta). S kontrolnimi eksperimenti, kjer posnamemo sliko GUV brez prisotnosti nanodelcev, izmerimo še bledenje membranskih označevalcev. Eksperimenti za določanje bledenja nanodelcev so nepotrebni, saj nanodelci ne bledijo. S pridobljeno referenco za membranske označevalce sliko popravimo za nadaljnjo obdelavo. 13

15 Slika 10 Grafa (A) prikazujeta ločena spektra donorja (levo) in akceptorja (desno). (B) Prikaz meritve FRET. (C) Prikaz ločevanja komponent meritve FRET. Modra črta prikazuje emisijski spekter donorja, rdeča črta pa komponento emisijskega spektra akceptorja. onor in akceptor v grafih služita za razlago uporabljenega pristopa k meritvi FRET in nista fluorescenčni barvili, uporabljeni v meritvi. Meritev pokaže, da se pričakovano v okolici membrane ob povečanju koncentracije nanodelcev v bližini GUV poveča intenziteta njihove emisije (slika 9A), hkrati pa se poveča emisija membranskih označevalcev (slika 9B). Ker so membranski označevalci dobro določeni in se iz drugih razlogov njihova emisija ne more povečati, smo s tem dobili dokaz, da so v njihovi bližini (manj kot 10 nm) nanodelci. S prenosom energije preko FRET iz barvila na nanodelcih na barvilo na membrani torej razložimo povečano emisijo membranskih označevalcev. 5 Zaključek Mikroskopija s Försterjevim prenosom energije omogoča določanje razdalj med molekulami daleč pod limito optičnega mikroskopa. Skupaj z ostalimi procesi (optična pinceta, spektroskopija ) nam nudi vpogled v procese, ki so se nedolgo nazaj zdeli še povsem nedostopni. V zadnjih desetletjih je mikroskopija FRET postala ena izmed osnovnih tehnik za raziskovanje bioloških procesov in nanodelcev, še vedno hiter razvoj tehnologije pa obljublja veliko novih odkritij s pomočjo FRET tudi v prihodnosti. 14

16 6 Viri [1] Ishikawa-Ankerhold, H., Ankerhold, R., rummen, G. P. C., Advanced Fluorescence Microscopy Techniques FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules, 17: , 01. [] Urbančič, I Odziv biomembranskih domen na zunanje dražljaje. oktorska disertacija. Maribor, Fakulteta za naravoslovje in matematiko: [3] Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET Imaging. Nature Biotechnology, 1(11): , November 003. [4] Sun, Y. et al. Förster Resonance Energy Transfer Microscopy and Spectroscopy for localizing Protein-Protein interactions in Living Cells. Cytometry A, 83(9):780-93, September 013. [5] Smyth, C. A., Rakovich, Y. P., McCabe, E. M. Surface Plasmon Enhanced Imaging. Research. Photonics Group. Trinity College ublin. (Citirano ) [6] Kremers, G.-J., Piston,. W., avidson, M. W. Fundamental Principles of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy with Fluorescent Proteins. Mycroscopy U, (Citirano ). [7] Herman, B. et al. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Mycroscopy. Olympus America Mycroscopy Research Center, (Citirano ) [8] Tokmakoff, A. Introductory Quantum Mechanics II. Spring 009. (Massachusetts Institute of Technology: MIT OpenCourseWare), (Citirano ). Licenca: Creative Commons BY-NC-SA [9] Pietraszewska-Bogiel, A., Gadella, T. W. J. FRET microscopy: from principle to routine technology in cell biology. Journal of Mycroscopy, 41(): , 010. [10] Padilla-Parra, S., Tramier, M. FRET microscopy in the living cell: ifferent approaches, strengths and weaknesses. Bioessays Journal, 34: , 01 [11] Garsha, K. Spectral Methods for Biological Analysis. Photonics, (Citirano ) [1] Garvas, M. Neobjavljeno. 15