EE-EP B1. järjestus.

Transcription

1

2

3 1 2 LEIUTISE TAUST Paljuraksetes organismides reguleerivad rakkude paljunemist ja diferentseerumist hormoonid ja polüpeptiidsed kasvufaktorid. Sellised difundeeruvad molekulid võimaldavad rakkudel üksteisega suhelda ja moodustada omavahelises koostöös rakke, kudesid ja elundeid ning parandada kahjustatud kudesid. Hormoonide ja kasvufaktorite seas on näiteks steroidhormoonid (nt östrogeen, testosteroon), paratüroidhormoon, folliikuleid stimuleeriv hormoon, interleukiinid, trombotsüütidest pärinev kasvufaktor (PDGF), epidermaalne kasvufaktor (EGF), granulotsüütide ja makrofaagide kolooniaid stimuleeriv faktor (GM-CSF), erütropoietiin (EPO) ja kaltsitoniin. Hormoonid ja kasvufaktorid mõjutavad rakkude ainevahetust retseptoritega seondumise teel. Retseptorid võivad olla integraalsed membraanivalgud, mis on rakus seotud signaaliradadega nagu sekundaarsed messenger-süsteemid. Teised retseptoriklassid on lahustuvad molekulid nagu transkriptsioonifaktorid. Tsütokiinid üldjuhul stimuleerivad hematopoeetilistesse rakuliinidesse kuuluvate rakkude proliferatsiooni ja diferentseerumist või osalevad organismi immuun- ja põletikulise vastuse tekkega seotud mehhanismides. Hematopoeesi mõjutavad tsütokiinid on näiteks erütropoietiin (EPO), mis stimuleerib punaste vereliblede teket, trombopoietiin, mis stimuleerib megakarüotsüütide rakuliinidesse kuuluvate rakkude teket, ja granulotsüütide kolooniaid stimuleeriv faktor (G-CSF), mis stimuleerib neutrofiilide teket. Need tsütokiinid on kasulikud vereliblede normaalse taseme taastamisel patsientidel, kes põevad aneemiat, trombotsütopeeniat ja neutropeeniat või kes saavad vähktõve vastast keemiaravi. Interleukiinid on tsütokiinide perekond, mis vahendab immunoloogilisi vastuseid, sealhulgas põletikulist vastust. Interleukiinid vahendavad mitmesuguseid põletikulisi patoloogiaid. Immuunvastuse tekke seisukohalt on väga olulised T-rakud, mis toodavad paljusid tsütokiine ja tagavad organismi immuunsuse antigeenide suhtes. T-rakkude toodetavad tsütokiinid on jaotatud 1. tüübiks ja 2. tüübiks (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76:0-317, 1998). 1. tüübi tsütokiinide seas on IL-2, IFN-γ, LT-α ja nad osalevad põletikulistes vastustes, immuunsuses viiruste suhtes, immuunsuses intratsellulaarsete

4 2 parasiitide suhtes ja allografti hülgamises. 2. tüübi tsütokiinide seas on IL-4, IL-, IL-6, IL- ja IL-13 ja nad osalevad humoraalsetes vastustes, immuunsuses ussnugiliste suhtes ja allergilises vastuses. Nii tüüpi 1. kui ka tüüpi 2. kuuluvate tsütokiinide seas on IL-3, GM-CSF ja TNF-α. Praeguseks on saadud tõendeid selle kohta, et 1. ja 2. tüüpi tsütokiine tootvad T-rakkude populatsioonid migreeruvad eelistavalt erinevat tüüpi põletikust haaratud kudedesse. Küpsed T-rakud suudavad antigeeni või muu stiimuli toimel toota näiteks tsütokiine, biokeemilisi signaliseerivaid molekule või retseptoreid, mis omakorda mõjutavad T- rakkude populatsiooni edasist käekäiku. 1 B-rakud täidavad nende rakkude pinnal paiknevate retseptorite, sealhulgas B-rakkude retseptorite ja teiste lisamolekulide kaudu aktiveerimise korral lisarakkude ülesannet, näiteks toodavad tsütokiine. Monotsüüte/makrofaage ja T-rakke suudavad aktiveerida nende rakkude pinnal paiknevad retseptorid ja neil on immuunvastuse tekkes keskne roll, mis seisneb antigeeni esitlemises lümfotsüütidele ja lümfotsüütide funktsiooni toetamises paljude tsütokiinide tootmise teel. Looduslikel tapjarakkudel (NK-rakud) on T- ja B-rakkudega ühine eellasrakk ja nad mängivad olulist rolli immuunsüsteemi järelevalves. NK-rakud, mis moodustavad kuni 1% veres sisalduvatest lümfotsüütidest, ei ekspresseeri antigeenide retseptoreid ja seega ei ole sihtrakuga seondumiseks vajalik MHC äratundmine. 2 NK-rakud osalevad teatud kasvajarakkude ja viirusega nakatunud rakkude äratundmises ja hävitamises. Arvatakse, et NK-rakke on in vivo vaja aktiveerida, kuid in vitro on näidatud, et NK-rakud hävitavad mõnesid kasvajarakkude tüüpe ilma aktiveerimata. DATABASE EMBL registreerimisnumbriga AC (16. aprill 00) pakutakse Homo sapiens 12 BAC RP211-12M8. DATABASE EMBL registreerimisnumbriga AK00939 (8. veebruar 01) pakutakse Mus musculus täiskasvanud munandi cdna, RIKEN täispikk rikastatud pank, kloon: b14 produkt: hüpoteetiline valk, täielik inserdi

5 3 järjestus. Tsütokiinide perekonna näidatud in vivo aktiivsused annavad tunnistust teiste tsütokiinide, tsütokiini agonistide ja tsütokiini antagonistide ülisuurest kliinilisest potentsiaalist ja vajadusest nende järele. Käesolevas patendikirjelduses kirjeldatakse uudset tsütokiini, mis stimuleerib kõiki hematopoeetilist päritolu rakke, ja ka nendega seotud kompositsioone ja meetodeid. 1 2 Käesoleva leiutisega pakutakse antikeha või antikeha fragment, mis seondub spetsiifiliselt SEQ ID NO:2 segmendiga, kusjuures nimetatud segment koosneb järjestuse SEQ ID NO:2 kuni 0 külgnevast aminohappest ja see segment sisaldab aminohappeid, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad (a) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 4 kuni 9; (b) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 129 kuni 134; (c) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 3 kuni 8; (d) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 3 kuni 40; (e) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 33 kuni 38; (f) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 114 kuni 119; (g) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 1 kuni ; (h) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 126 kuni 131; (i) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 113 kuni 118; ja (j) järjestuse SEQ ID NO:2 aminohappejäägid 18 kuni 162. Käesoleva leiutisega pakutakse antikeha või antikeha fragment, mis seondub spetsiifiliselt polüpeptiidiga, mis koosneb aminohappejääkidest, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: (a) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 4 kuni 9; (b) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 129 kuni 134; (c) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 3 kuni 8; (d) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 3 kuni 40; (e) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 33 kuni 38; (f) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 114 kuni 119; (g) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 1 kuni ; (h) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 126 kuni 131; (i) järjestuse SEQ ID NO: 2 aminohappejäägid 113 kuni 118; ja (j) SEQ ID NO:2 aminohappejäägid 18 kuni 162. Käesoleva leiutisega pakutakse ka isoleeritud antikeha või antikeha fragment, mis seondub spetsiifiliselt polüpeptiidiga, mis koosneb järjestuse SEQ ID NO: 11 segmendist, kusjuures see segment koosneb järjestuse SEQ ID NO:11 kuni 0 külgnevast

6 4 aminohappejäägist ja nimetatud segment sisaldab aminohappelist järjestust, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: (a) järjestuse SEQ ID NO: 11 aminohappejäägid 34 kuni 39; (b) järjestuse SEQ ID NO: 11 aminohappejäägid 46 kuni 1; (c) järjestuse SEQ ID NO:11 aminohappejäägid 131 kuni 136; (d) järjestuse SEQ ID NO: 11 aminohappejäägid 18 kuni 163; ja (e) järjestuse SEQ ID NO:11 aminohappejäägid 17 kuni 162. Käesoleva leiutisega pakutakse ka antikeha või antikeha fragment, mis seondub spetsiifiliselt polüeptiidiga, mis koosneb aminohapetest, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad: (a) järjestuse SEQ ID NO: 11 aminohappejäägid 34 kuni 39; (b) järjestuse SEQ ID NO: 11 aminohappejäägid 46 kuni 1; (c) järjestuse SEQ ID NO:11 aminohappejäägid 131 kuni 136; (d) järjestuse SEQ ID NO: 11 aminohappejäägid 18 kuni 163; ja (e) järjestuse SEQ ID NO:11 aminohappejäägid 17 kuni Käesoleva leiutisega pakutakse eespool määratletud leiutisekohase antikeha kasutamine järjestuse SEQ ID NO:2 aminohappejääke 27 kuni 164 sisaldava või järjestuse SEQ ID NO:11 aminohappejääke 27 kuni 164 sisaldava polüpeptiidi poolt indutseeritud põletiku vähendamisel. Käesoleva leiutisega pakutakse eespool määratletud leiutisekohase antikeha kasutamine põletikulise haigusega imetaja ravis, kusjuures selliselt kasutatav antikeha seondub spetsiifiliselt SEQ ID NO:2 aminohappejääke 27 kuni 164 sisaldava või järjestuse SEQ ID NO:11 aminohappejääke 31 kuni 163 sisaldava polüpeptiidiga. 2 Käesoleva leiutisega pakutakse eespool määratletud leiutisekohase antikeha kasutamine põletikuga imetajal põletikulise vastuse supresseerimise meetodil, kusjuures see meetod koosneb järgmistest etappidest: (1) põletikulise molekuli taseme määramine; (2) kõnealuse ravimi manustamine; (3) põletikulise molekuli taseme määramine pärast ravimi manustamist; (4) etapis (1) määratud põletikulise molekuli taseme võrdlemine etapis (3) määratud põletikulise molekuli tasemega, kusjuures põletikulise molekuli taseme stabiilsus või langemine annab märku põletikulise vastuse supresseerimisest. Leiutisega pakutakse ka SEQ ID NO:2 aminohappejääke 27 kuni 164 sisaldava või järjestuse SEQ ID NO:11 aminohappejääke 31 kuni 163 sisaldava polüpeptiidi sisalduse in

7 vitro detekteerimise meetod bioloogilises proovis, kusjuures see meetod koosneb järgmistest etappidest: (a) bioloogiline proov viiakse kokkupuutesse käesoleva leiutise kohase antikeha või antikeha fragmendiga, kusjuures kokkupuutesse viimine toimub tingimustes, milles antikeha või antikeha fragment saab seonduda bioloogilise prooviga, ja (b) tuvastatakse seondunud antikeha või seondunud antikeha fragment. 1 Käesoleva leiutisega pakutakse ka in vitro meetod patsiendil põletiku tuvastamiseks, mis koosneb järgmistest etappidest: (a) patsiendilt pärinevat koeproovi või bioloogilist proovi inkubeeritakse eespool määratletud käesoleva leiutise kohase antikehaga tingimustes, milles antikeha seondub koes või bioloogilises proovis komplementaarse polüpeptiidiga; (b) visualiseeritakse koes või bioloogilises proovis seondunud antikeha ja (c) võrreldakse patsiendilt pärinevas koes või bioloogilises proovis seondunud antikeha taset tervelt indiviidilt pärineva kontrollkoe või bioloogilise prooviga, kusjuures patsiendi koes või bioloogilises proovis mõõdetud seondunud antikeha kõrgem tase võrreldes tervelt indiviidilt pärineva kontrollkoe või bioloogilise prooviga näitab seda, et patsiendi organismis on põletik. 2 JOONISTE LÜHIKIRJELDUS Joonisel fig 1 on inimese zcytor171ig (SEQ ID NO:2) (zcytor17lig), hiire zcytor17lig (SEQ ID NO:11) (mzcytor17lig), hiire IL-3 (mil-3) (SEQ ID NO:0) ja inimese IL-3 (hil-3) (SEQ ID NO:2) illustreeriv reastus. Joonisel fig 2 on inimese zcytor17lig (SEQ ID NO:2) (zcytor17lig) ja hiire zcytor171ig (SEQ ID NO:11) (mzcytor17lig) illustreeriv reastus. Joonisel fig 3 on inimese zcytor17lig (SEQ ID NO:2) Hopp/Woods hüdrofiilsuse graafik. LEIUTISE ÜKSIKASJALIK KIRJELDUS Enne käesoleva leiutise üksikasjalikku kirjeldamist määratletakse sellest arusaamise hõlbustamiseks järgmised mõisted: Käesolevas kontekstis on afiinsusmärgis polüpeptiidne segment, mille saab kinnitada teise polüpeptiidi külge, et oleks võimalik isoleerida või detekteerida nimetatud teist polüpeptiidi või luua teise polüpeptiidi ja substraadi vaheline kinnituskoht. Afiinsusmärgisena saab põhimõtteliselt kasutada mis tahes peptiidi või valku, mille korral

8 6 1 on olemas selle suhtes spetsiifiline antikeha või muu spetsiifiline sidumisaine. Afiinsusmärgiste seas on polühistidiini rühm, valk A (Nilsson et al., EMBO J. 4:7, 198; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), glutatioon-s-transferaas (Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988), Glu-Glu afiinsusmärgis (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:792-4, 198), aine P, Flag peptiid (Hopp et al., Biotechnology 6:14-, 1988), streptavidiini siduv peptiid või muu antigeeni epitoop või sidumisdomeen. Vt üldteavet allikast Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 9-7, Afiinsusmärgiseid kodeerivad DNA-d on kaubanduslikult kättesaadavad (nt Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Käesolevas kontekstis on alleelne variant samas kromosoomi lookuses paikneva geeni mis tahes vorm selle kahe või rohkema alternatiivse vormi seas. Alleelne variatsioon tekib looduslikult mutatsiooni tulemusena ja selle tagajärjel võivad tekkida populatsioonides fenotüüpne polümorfism. Geenimutatsioonid võivad olla vaikivad (mille puhul ei ole kodeeritavad polüpeptiidis muutusi) või nende tulemusena võib kodeeritud polüpeptiididel olla muutunud aminohappeline järjestus. Käesolevas kontekstis tähistatakse mõistega alleelne variant ka valku, mida kodeerib geeni alleelne variant. 2 Käesolevas kontekstis kasutatakse mõisteid amino-terminaalne ja karboksüterminaalne polüpeptiidisiseste positsioonide tähistamiseks. Kui kontekst seda lubab, kasutatakse neid mõisteid polüpeptiidi konkreetse järjestuse või segmendi puhul läheduse või suhtelise asendi tähistamiseks. Näiteks, teatud järjestus, mis paikneb polüpeptiidis referentsjärjestuse suhtes karboksü-terminaalselt, paikneb referentsjärjestuse karboksüülotsa suhtes proksimaalselt, kuid ei paikne tingimata tervikliku polüpeptiidi karboksüülotsas. Komplemendi/antikomplemendi paari all peetakse silmas mitteidentseid fragmente, mis moodustavad sobivates tingimustes mittekovalentselt seotud stabiilse paari. Komplemendi/antikomplemendi paari prototüüpsed liikmed on näiteks biotiin ja avidiin (või streptavidiin). Teiste komplemendi/antikomplemendi paaride seas on näiteks retseptori/ligandi paarid, antikeha/antigeeni (või hapteeni või epitoobi) paarid, senss-

9 7 /antisenss-polünukleotiidi paarid ja teised sarnased paarid. Kui soovitakse komplemendi/antikomplemendi paari järgnevat dissotsieerumist, on sellise komplemendi/antikomplemendi paari seondumise afiinsus eelistatavalt < 9 M -1. Polünukleotiidi molekuli kompement on polünukleotiidi molekul, millel on referentsjärjestuse suhtes komplementaarne alusjärjestus ja vastupidine (reverse) orientatsioon. Näiteks järjestus ' ATGCACGGG 3' on komplementaarne järjestusega ' CCCGTGCAT 3'. 1 Mõistet contig kasutatakse seoses polünukleotiidiga, millel on teise polünukleotiidi suhtes külgnev identse või komplementaarse järjestuse lõik. Külgnevad järjestused kattuvad. Öeldakse, et külgnevad järjestused kattuvad üle ( overlap ) kas antud polünukleotiidse järjestuse ulatuses täielikult või piki polünukleotiidi osaliselt. Polünukleotiidse järjestuse '-ATGGCTTAGCTT-3' suhtes on külgnevad (contiguous) järjestused näiteks '-TAGCTTgagtct-3' ja 3'-gtcgacTACCGA-'. Kõdunud nukleotiidne järjestus on nukleotiidide järjestus, mis sisaldab üht või mitut kõdunud koodonit (võrreldes polüpeptiidi kodeeriva referents-polünukleotiidimolekuliga). Kõdunud koodonid sisaldavad erinevaid nukleotiidide triplette, kuid nad kodeerivad samu aminohappejääke (ehk nii GAU kui ka GAC tripletid mõlemad aminohappejääki Asp). 2 Ekspressioonivektor on lineaarne või tsirkulaarne DNA molekul, mis sisaldab huvipakkuvat polüpeptiidi kodeerivat segmenti, mis on funktsionaalselt seotud teiste segmentidega, mis osalevad selle transkriptsioonis. Selliste teiste segmentide seas on promootor- ja terminaatorjärjestused ja nende seas võib olla ka üks või mitu replikatsiooni alguspunkti, üks või mitu selektsioonimarkerit, enhanser, polüadenüleerimise signaal jne. Ekspressioonivektorid valmistatakse tavaliselt plasmiidist või viiruse DNA-st või mõlema elementidest. Polünukleotiidi puhul tähendab isoleeritud seda, et see polünukleotiid on eemaldatud selle loomulikust keskkonnast, ei sisalda seetõttu teisi võõr- või soovimatuid järjestusi ning on vormis, mida saab kasutada geneetiliselt loodud valgutootmissüsteemide

10 8 valmistamiseks. Sellised isoleeritud molekulid on eraldatud nende loomulikust keskkonnast ja nende seas on cdna ja genoomsed kloonid. Käesoleva leiutise kohased isoleeritud DNA molekulid ei sisalda teisi geene, millega nad tavaliselt on seotud, aga nad võivad sisaldada looduslikke ' ja 3' transleerimata piirkondi nagu promootorid ja terminaatorid. Asjatundjad oskavad selliseid seotud piirkondi kergesti määrata (vt nt Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 198). 1 Isoleeritud polüpeptiid või valk on polüpeptiid või valk, mis ei ole oma looduslikus keskkonnas nagu osa verest või loomsest koest. Eelistatud vormi korral ei sisalda isoleeritud polüpeptiid olulisel määral teisi polüpeptiide, eeskätt teisi loomset päritolu polüpeptiide. Sellised polüpeptiidid on eelistatavalt ülipuhtal kujul ehk nende puhtusaste on kõrgem kui 9%, eelistatavalt kõrgem kui 99%. Antud kontekstis kuuluvad isoleeritud polüpeptiidide hulka ka sama polüpeptiidi alternatiivsed füüsikalised vormid nagu dimeerid või alternatiivselt glükosüülitud või mingil muul viisil derivatiseeritud vormid. Neoplastilised rakud on rakud, millega toimub uus ja ebanormaalne proliferatsioon, eeskätt koes, kus toimub kontrollimatu ja progresseeruv proliferatsioon, mille tulemusel tekib neoplasm. Neoplastilised rakud võivad olla pahaloomulised ehk invasiivsed ja metastaatilised või healoomulised. Funktsionaalselt seotud tähendab DNA segmentide puhul seda, et nende segmentide paigutus võimaldab neil koos täita teatud vajalikke ülesandeid, nt promootoris initsieeritakse transkriptsioon ja see kandub kodeerimissegmendi kaudu üle terminaatorile. 2 Ortoloog on ühelt liigilt pärinev polüpeptiid või valk, mis vastab funktsionaalselt teiselt liigilt pärinevale polüpeptiidile või valgule. Ortoloogide seas esinevad järjestuste erinevused tulenevad spetsiatsioonist. Paraloogid on selgesti eristuvad, kuid organismi toodetud valkudega struktuuri poolest sarnased valgud. Arvatakse, et paraloogid tekivad geenide duplitseerimise tulemusel. Näiteks α-globiin, β-globiin ja müoglobiin on üksteise analoogid.

11 9 Polünukleotiid on deoksünukleotiid- või ribonukleotiidaluste ühe- või kaheahelaline polümeer, mida loetakse ' otsast 3' otsa. Polünukleotiidide hulka kuuluvad RNA ja DNA ja neid saab isoleerida looduslikest allikatest, sünteesida in vitro või valmistada looduslike ja sünteetiliste molekulide kombinatsioonist. Polünukleotiidide suurust väljendatakse aluspaaride (lühend bp), nukleotiidide (nt) või kiloalustena (kb). Kui kontekst seda lubab, kirjeldatakse kahe viimatinimetatud mõistega ühe- või kaheahelalisi polünukleotiide. Kui seda mõistet kasutatakse kaheahelaliste molekulide puhul, tähistatakse sellega nende üldpikkust ja see on samaväärne mõistega aluspaarid. Asjatundjad mõistavad, et kaheahelalise polünukleotiidi kaks ahelat võivad olla veidi erineva pikkusega ja et nende otsad võivad olla ensümaatilise lõhustamise tulemusena staggered ehk kaheahelalise polünukleotiidi molekulis ei tarvitse kõik nukleotiidid olla paardunud. 1 Polüpeptiid on looduslik või sünteetiline polümeer, mis koosneb peptiidsidemetega ühendatud aminohappejääkidest. Polüpeptiide, mis koosnevad vähem kui umbes aminohappejäägist, nimetatakse tavaliselt peptiidideks. Käesolevas kontekstis kasutatakse mõistet promootor selle tuntud tähenduses ehk selle all peetakse silmas geeni segmenti, mis sisaldab DNA järjestusi, mis osalevad RNA polümeraasi seondumises ja transkriptsiooni initsieerimises. Promootorjärjestused paiknevad tavaliselt, kuid mitte alati, geenide mittekodeerivates piirkondades. 2 Valk on makromolekul, mis sisaldab üht või mitut polüpeptiidahelat. Valk võib sisaldada ka mittepeptiidseid komponente nagu süsivesikrühmad. Süsivesikud ja teised mittepeptiidsed asendajad võib valku lisada rakk, mis toodab seda valku, ja need on erinevat tüüpi rakkude puhul erinevad. Käesolevas dokumendis määratletakse valke nende aminohappelise selgroo struktuuride järgi, asendajaid nagu süsivesikrühmad tavaliselt küll ei määratleta, kuid nad võivad valgus olemas olla. Retseptor on rakuga seotud valk, mis seondub bioaktiivse molekuliga (ehk ligandiga) ja vahendab ligandi toimet rakule. Membraaniga seotud retseptoritele on iseloomulik multipeptiidne struktuur, mis sisaldab ekstratsellulaarset ligandi sidumisdomeeni ja intratsellulaarset efektordomeeni, mis tavaliselt osaleb signaalide edasikandes. Ligandi

12 seondumisel retseptoriga tekib retseptoris konformatsiooniline muutus, mis kutsub rakus esile efektordomeeni ja teise molekuli(de) vahelise interaktsiooni. See interaktsioon omakorda muudab raku metabolismi. Retseptori ja ligandi vaheliste interaktsioonidega seotud metaboolsete sündmuste seas on geeni transkriptsioon, fosforüüliline, defosforüülimine, tsüklilise AMP tootmise intensiivistumine, tsellulaarse kaltsiumi mobiliseerimine, rakkude adhesioon, inositoollipiidide hüdrolüüs ja fosfolipiidide hüdrolüüs. Retseptorid võivad üldjuhul olla membraaniga seondunud, tsütosoolsed või nukleaarsed, monomeersed (nt türoidi stimuleeriva hormooni retseptor, beetaadrenergiline retseptor) või multimeersed (nt PDGF retseptor, kasvuhormooni retseptor, IL-3 retseptor, GM-CSF retseptor, G-CSF retseptor, erütropoietiini retseptor ja IL-6 retseptor). 1 Sekretoorne signaaljärjestus on DNA järjestus, mis kodeerib polüpeptiidi ( sekretoorset peptiidi ), mis suurema polüpeptiidi osana suunab suurema polüpeptiidi läbi rakus, milles seda sünteesitakse, sekretoorse raja. Sekretsioonirajal kulgemise käigus suurem polüpeptiid tavaliselt lõhustatakse ja eemaldatakse sekretoorne peptiid. Käesolevas kontekstis peetakse splaissivariantide all silmas geenist transkribeeritava RNA alternatiivseid variante. Splaissivariandid tekivad loomulikult alternatiivsete splaissimissaitide kasutamisel transkribeeritud RNA molekulis või harvemini eraldi transkribeeritud RNA molekulide vahel ja nende tulemusel võidakse samast geenist transkribeerida mitu RNA molekuli. Splaissivariandid võivad kodeerida polüpeptiidid, millel on 2 Ebatäpsete analüüsimeetoditega (nt geelelektroforees) määratud polümeeride molekulmasse ja pikkusi tuleb käsitada ligikaudsete väärtustena. Kui sellisele väärtusele eelneb laiend umbes X või ligikaudu X, on toodud väärtuse X täpsuseks ±%. Käesolevas patendikirjelduses kirjeldatakse avastatud uudset DNA järjestust, mis kodeerib valku, millel on neli-heeliks-kimp tsütokiini struktuur. Käesolevas dokumendis üksikasjalikult kirjeldatud kloonimisprotsesside ja proliferatsioonikatsete abil on määratud polünukleotiidne järjestus, mis kodeerib uudse ligandi polüpeptiidi, mille näol on tegemist ligandiga, millel on kõrge spetsiifilisus retseptori zcytor17 (SEQ ID NO:) suhtes ja

13 11 vähemalt veel ühe, onkostatiini M retseptor beeta (OSMRbeta) (SEQ ID NO:7) ja WSX-1 (SEQ ID NO:9) sisaldava alamühiku suhtes. Selline polüpeptiidi ligand tähisega zcytor17lig isoleeriti cdna pangast, mis loodi CD3 suhtes selekteeritud aktiveeritud inimese perifeerse vere rakkudest (hpbcs). CD3 on rakupinna marker, mis on omane vaid lümfirakkudele, eeskätt T-rakkudele. 1 Alljärgnevates näidetes püüti rakuliiniga, mille ellujäämine ja kasvamine sõltub teiste kasvufaktorite puudumise korral OSMRbeta ja zcytor17 retseptoriga seotud rajast või sõltub OSMRbeta ja WSX-1 ja zcytor17 retseptoriga seotud rajast, skriinimise teel määrata zcytor17lig-d kodeeriva cdna allikat. Eelistatud kasvufaktorist sõltuv rakuliin, mida kasutati zcytor17 retseptori transfekteerimiseks ja ekspresseerimiseks, oli BaF3 (Palacios and Steinmetz, Cell 41: , 198; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: , 1986). Selleks sobivad aga ka teised kasvufaktorist sõltuvad rakuliinid nagu FDC-P1 (Hapel et al., Blood 64: , 1984) ja MO7e (Kiss et al., Leukemia 7: , 1993). 2 OSMR, WSX-1 ja zcytor17 aminohappelised järjestused näitasid, et kodeeritud retseptorid kuulusid I klassi tsütokiini retseptorite alamperekonda, milles on näiteks, kuid mitte ainult, IL-2, IL-4, IL-7, Lif, IL-12, IL-1, EPO, TPO, GM-CSF ja G-CSF (vt ülevaadet allikast Cosman, The Hematopoietin Receptor Superfamily, Cytokine (2): 9-6,1993). zcytor17 retseptorit kirjeldatakse põhjalikult commonly-owned PCT patenditaotluses nr US01/484 (WIPO publikatsioon nr WO 02/00721) ja WSX-1 kirjeldatakse põhjalikult US patendis nr.92,73. zcytor17 retseptori mrna koes jaotumise analüüs näitas, et seda ekspresseeritakse aktiveeritud CD4+ ja CD8+ T-rakkude alarühmades, CD14+ monotsüütides ja nõrgemalt CD19+ B-rakkudes. mrna tuvastati nii puhkeseisundis olevates kui ka aktiveeritud monotsüütilistes rakuliinides THP-1 (ATCC registeerimisnumber TIB-2), U937 (ATCC registreerimisnumber CRL-193.2) ja HL60 (ATCC registreerimisnumber CCL-240). WSX-1-e ekspresseeritakse kõige intensiivsemalt tüümuses, põrnas, PBL-is ja lümfisõlmedes ja selle ekspressiooni intensiivistumist on täheldatud ka aktiveeritud T- rakkudes. Kirjelduste kohaselt on OSMRbeta jaotumine kudedes väga lai. Nende kolme

14 12 retseptori jaotumisest kudedes saab järeldada, et prognoositava Zcytor17lig üheks sihtmärgiks on hematopoeetilist päritolu rakud, eeskätt T-rakud, monotsüüdid/makrofaagid ja lümfoidsed eellasrakud ja lümfoidsed rakud. Teiste tuntud, lümfoidseid rakke mõjutavate neli-heeliks-kimp tsütokiinide seas on IL-2, IL-4, IL-7 ja IL-1. Ülevaade neli-heeliks-kimp tsütokiinidest on toodud allikas Nicola et al., Advances in Protein Chemistry 2:1-6, 1999 and Kelso, A., Immunol. Cell Biol. 76:0-317, Konditsioneeritud sööde (CM), mis koosnes CD3+ selekteeritud, PMA/ionomütsiinstimuleeritud inimese perifeerse vere rakkudest toetas zcytor17 retseptorit, OSMRbeta ja WSX-1 retseptorit ekspresseerivate ja muul viisil IL-3-est sõltuvate BaF3 rakkude kasvu. Konditsioneeritud söötmed, mis olid valmistatud rakkudest, mis 1) ei olnud PMA/ionomütsiiniga stimuleeritud või mis 2) ei olnud CD3 suhtes selekteeritud (PMA/ionomütsiiniga stimuleeritud või mitte) ei soodustanud zcytor17 retseptorit, OSMRbeta ja WSX-1 (BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta) retseptorit ekspresseerivate rakkude kasvu. Kontrollkatsed näitasid, et sellist proliferatsiooni ei saanud seostada teiste tuntud faktoritega ja et selliste konditsioneeritud söötmete võimet stimuleerida zcytor17/wsx-1/osmrbeta retseptorit ekspresseerivate rakkude proliferatsiooni saab neutraliseerida zcytor17 retseptori lahustuva vormiga. 2 PMA/ionomütsiiniga aktiveeritud CD3+ selekteeritud rakkudest valmistatud konditsioneeritud sööde samuti soodustas zcytor17 retseptorit ja OSMRbeta retseptorit (zcytor17/osmrbeta) ekspresseerivate BaF3 rakkude kasvu, kuid selline konditsioneeritud sööde ei stimuleerinu BaF3 rakke, mis ekspesseerisid ainult zcytor17 retseptorit ja WSX-1 retseptorit (zcytor17/wsx-1) või sisaldasid ainult OSMRbeta retseptorit. Perifeersetest CD3+ selekteeritud, PMA/ionomütsiiniga stimuleeritud vererakkudest valmistatud konditsioneeritud söötmega kokkupuutesse viidud zcytor17fwsx- 1/OSMRbeta retseptorit ekspresseerivate BaF3 rakkude proliferatsioon määrati kasvukultuuride visuaalse vaatluse ja/või proliferatsioonikatse abil. Paljud sobivad proliferatsioonikatsed on tehnika tasemes tuntud ja nende seas on redutseerimiskatsed, mis viiakse läbi värvainega nagu AlamarBlue (AccuMed International, Inc. Westlake,

15 13 Ohio), 3-(4,-dimetüültiasool-2-üül)-2.-difenüültetrasooliumbromiid (Mosman, J. Immunol. Meth. 6: -63, 1983); 3,(4, dimetüültiasool-2-üül)--3- karboksümetoksüfenüül-2h-tetrasoolium; 2,3-bis(2-metoksü-4-nitro--sulfofenüül)-- [(fenüülamino)karbonüül]-2h-tetrasooliumhüdroksiid ja tsüanoditolüültetrasooliumkloriid (mida turustab ettevõte Polysciences, Inc., Warrington, PA); mitogeneesi katsed nagu 3 H-tümidiini inkorporeerimise mõõtmine; värvaine välistamise katse, milles kasutatakse näiteks naftaleenmusta või trüpaansinist värvainet; värvaine imendumise katse, milles kasutakse diatsetüülfluorestseiini ja kroomi vabanemise katse. Üldteavet leidub allikas Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3rd ed., Wiley-Liss, 1994, mis kaasatakse viitena käesolevasse dokumenti. 1 2 CD3+ selekteeritud, PMA ja ionomütsiiniga stimuleeritud primaarsetest inimese perifeerse vere rakkudest valmistati cdna pank. CD3+ selekteeritud, PMA ja ionomütsiiniga stimuleeritud primaarsetest inimese perifeerse vere rakkudest valmistatud cdna pank jagati osadeks/kogumiteks, mis sisaldasid paljusid cdna molekule, ja transfekteeriti peremeesrakuliini, näiteks BHK 70 rakkudesse (ATCC registreerimisnumber 314). Transfekteeritud peremeesrakke kasvatati söötmes, mis ei sisaldanud eksogeenseid kasvufaktoreid (nt % FBS) ja konditsioneeritud sööde koguti kokku. Konditsioneeritud söödet analüüsiti, et teha kindlaks võime stimuleerida zcytor17, WSX-1 ja OSMRbeta retseptoritega transfekteeritud BaF3 rakkude proliferatsiooni. Seejärel määrati CDNA kogumid, mis tootsid konditsioneeritud söödet, mis stimuleeris BaF3/zcytor17/WSX- 1/OSMRbeta retseptori rakke. Koondatud plasmiidi cdna sisestati elektroporeerimise teel E. coli bakteritesse. Üksikkolooniatest isoleeriti CDNA ja transfekteeriti eraldi BHK 70 rakkudesse. Positiivsed kloonid määrati BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta retseptori proliferatsioonikatses saadud positiivsete tulemuste järgi ja aktiivsust kontrolliti proliferatsiooni neutraliseerimise teel lahustuva zcytor17 retseptoriga. Isoleeriti positiivne kloon ja järjestuse analüüs näitas, et plasmiidi DNA-s sisalduv polünukleotiidne järjestus oli uudne. Sekretoorne signaaljärjestus koosneb aminohappejääkidest 1 (Met) kuni 23 (Ala) ja küps polüpeptiid koosneb aminohappejääkidest 24 (Ser) kuni 164 (Thr) (nagu on näidatud järjestuses SEQ ID NO:2). 293T rakkudest isoleeritud zcytor17lig edasine N-otsa sekveneerimisanalüüs

16 14 näitas, et Nots paiknes järjestuses SEQ ID NO:2 näidatud aminohappejäägi 27 (Leu) juures ja et küps polüpeptiid koosnes aminohappejääkidest 27 (Leu) kuni 164 (Thr) (nagu on näidatud järjestuses SEQ ID NO:2). 1 Tsütokiinidel on ennustustekohaselt üldjuhul neli-alfa-heeliksstruktuur, milles heeliksid A, C ja D mängivad ligandi-retseptori interaktsioonides kõige olulisemat rolli ja on selle pere teistest liikmetest rohkem konserveerunud. Võttes aluseks inimese zcytor17lig aminohappelise järjestuse, mis on näidatud järjestuses SEQ ID NO:2, inimese zcytor17lig, inimese IL-3, ja inimese tsütokiini aminohappeliste järjestuste rühmitumises, ennustatakse, et zcytor17lig heeliks A on määratud aminohappejääkidega 38-2, heeliks B aminohappejääkidega 83-98, heeliks C aminohappejääkidega ja heeliks D aminohappejääkidega , nagu on näidatud järjestuses SEQ ID NO:2. Struktuurianalüüsist saab järeldada, et A/B silmus on pikk, B/C silmus on lühike ja C/D silmus on pikk. Sellise silmusstruktuuri tulemusel moodustub üleval-üleval-all-all heeliksikujuline ülesehitus. 4-heeliks-kimp struktuuri põhjal vastavad zcytor17lig-is sisalduvad tsüsteiinijäägid, mis on konserveerunud, käesolevas dokumendis kirjeldatavatele järjestuse SEQ ID NO:2 aminohappejääkidele 72, 133 ja 147 ning järjestuse SEQ ID NO:11 aminohappejääkidele 74, 137 ja 11. Neli-heeliks-kimp struktuurist annab tunnistust ka kooskõlas olev tsüsteiini paigutus. zcytor17lig-is on väga konserveerunud ka Glu jääk, mis on näidatud järjestuses SEQ ID NO:2 aminohappejäägi positsioonil Hiire zcytor17lig ennustatav aminohappeline järjestus on 31% ulatuses identne ennustatud inimese valguga kogu järjestuste (SEQ ID NO:2 ja SEQ ID NO:11) pikkuses. Inimese ja hiire zcytor17lig järjestuste võrdlemise teel tehti kindlaks, et konserveerunud aminohappejäägid paiknesid piirkondades, mis ennustustekohaselt kodeerivad alfaheelikseid C ja D. Vastavad polünukleotiidid, mis kodeerivad käesolevas dokumendis kirjeldatavaid inimese zcytor17lig polüpeptiidide piirkondi, domeene, motiive, aminohappejääke ja järjestusi, on näidatud järjestuses SEQ ID NO:1. Heeliks D on inimese ja hiire zcytor17lig puhul suhteliselt konserveerunud, aga heeliks C on kõige rohkem konserveerunud. Kuna mõlemal liigil domineerivad selles piirkonnas

17 1 happelised aminohapped, võivad vastavad erinevused määrata liikide spetsiifilisuse zcytor17lig ja tema retseptori vahel, kusjuures zcytor17sisaldab monomeerseid, heterodimeerseid (nt zcytor17/osmrbeta, WSX-1/IOSMRbeta, zcytor17/wsx-1) või multimeerseid(nt zcytorl7/osmrbetaiwsx-1) retseptoreid. zcytor17lig silmus A/B ja heeliks B on marginaalselt konserveerunud ja heeliks C läbi silmuse C/D heeliksisse D on nende liikide puhul kõige konserveerunum, kusjuures selle piirkonnaga seotud konserveerumine näitab, et see on funktsionaalselt oluline. Inimese ja hiire zcytor17lig D- heeliksid on samuti konserveerunud. Zcytor17 retseptori antagoniste võb tähistada zcytor17lig D-heeliksi mutatsioonide järgi. Nende seas võib olla valgu kärpimine alates aminohappejäägist Thr16 (SEQ ID NO:2) või ligandi ja retseptori seondumist määravate, kuid signaliseerimise aktiivsust vähendavate aminohappejääkide konserveerumine. 1 2 Neli-heeliks-kimp valke rühmitatakse ka nende struktuuri kuuluvate heeliksite pikkuse järgi. Pika heeliksiga tsütokiinid koosnevad tavaliselt 24 kuni jääkheeliksist ja nende hulka kuuluvad IL-6, tsiliaarne neutrotroofne faktor (CNTF), leukeemiat inhibeeriv faktor (LIF) ja inimese kasvuhormoon (hgh). Lühikese heeliksiga tsütokiinid koosnevad tavaliselt 18 kuni 21 jääkheeliksist ja nende hulka kuuluvad IL-2, IL-4 ja GM-CSF. Arvatakse, et Zcytoz17lig on lühikese heeliksiga tsütokiinide rühma uus liige. CNTF ja IL-6-a läbiviidud uuringud näitasid, et IL-6 heeliksis saab CNTF heeliksi asendada ekvivalentse heeliksiga, andes seeläbi kimäärile CTNF-ile omase seonduvuse. Seega saab nelja heeliksiga tsütokiinide funktsionaalseid domeene määrata struktuurse homoloogia põhjal olenemata järjestuste identsusest ja nad suudavad säilitada kimääris funktsionaalse terviklikkuse (Kallen et al., J. Biol. Chem. 274: , 1999). zcytor17lig helikaalsed domeenid on seega kasulikud eeskätt teiste lühikese heeliksiga tsütokiinide kimäärsete fusioonmolekulide valmistamisel, et määrata ja moduleerida retseptoriga seondumise aktiivsust. Eriti huvipakkuvad on fusioonvalgud, mis on kosntrueeritud heeliksiga A ja/või heeliksiga D, ja fusioonvalgud, milles on kombineeritud teistelt lühikeste heeliksitega tsütokiinide nagu IL-2, IL-4, IL-1, Lif, I-12, IL-3 ja GM-CSF heeliksite ja silmuste domeene. Inimese IL-2 polünukleotiidne järjestus on näidatud järjestuses SEQ ID NO:161 ja vasta aminohappeline järjestus on näidatud järjestuses SEQ ID NO:162. Sekretoorne

18 16 1 signaaljärjestus koosneb järjestuse SEQ ID NO:162 aminohappejääkidest 1 (Met) kuni (Ser) ja järjestuse SEQ ID NO:161 nukleotiididest 48 to 7. Küps polüpeptiid koosneb järjestuse SEQ ID NO:162 aminohappejääkidest 21 (Ala) kuni 16 (Thr); järjestuse SEQ ID NO:161 nukleotiididest 8 kuni 1. Inimese IL-2 heeliks koosneb järjestuse SEQ ID NO:162 aminohappejääkidest 27 (Thr) kuni 48 (Leu); järjestuse SEQ ID NO:161 nukleotiididest 126 kuni 191. Inimese IL-2 heeliks B koosneb heeliksist B1 ja heeliksist B2. Inimese IL-2 heeliks B1koosneb järjestuse SEQ ID NO:162 aminohappejääkidest 73 (Ala) kuni 80 (Gln); järjestuse SEQ ID NO:161 nukleotiididest 264 kuni 287. Inimese IL- 2 heeliks B2 koosneb järjestuse SEQ ID NO:162 aminohappejääkidest 83 (Glu) kuni 92 (Val), järjestuse SEQ ID NO:161 nukleotiididest 294 kuni 323. IL-2 heeliks B (mis koosneb heeliksitest B1 ja B2) on seega aminohappelise järjestusega SEQ ID NO:168 (nukleotiidne järjestus SEQ ID NO:167), milles aminohappejäägid 9 ja võivad olla mis tahes aminohapped. Järjestus SEQ ID NO:168 on identne järjestuse SEQ ID NO:162 aminohapetega 73 (Ala) kuni 92 (Val), kusjuures aminohapped 81 ja 82 võivad olla mis tahes aminohape. Ühes eelistatud vormis sisaldab Il-2 heeliks B järjestuse SEQ ID NO:162 aminohappeid 73 (Ala) kuni 92 (Val); järjestuse SEQ ID NO:161nukleotiide 264 kuni 323. Inimese IL-2 heeliks C koosneb järjestuse SEQ ID NO:162 aminohappejääkidest 2 (His) kuni 116 (Val), järjestuse SEQ ID NO:161 nukleotiididest 31 kuni 39. Inimese IL-2 heeliks D koosneb järjestuse SEQ ID NO:162 aminohappejääkidest 134 (Thr) kuni 149 (Gln); järjestuse SEQ ID NO:161 nukleotiididest 447 kuni Inimese IL-4 polünukleotiidne järjestus on näidatud järjestuses SEQ ID NO:163 ja vastav aminohappeline järjestus on näidatud järjestuses SEQ ID NO:164. Sekretoorne signaaljärjestus koosneb järjestuse SEQ ID NO:164 aminohappejääkidest 1 (Met) kuni 24 (Gly); järjestuse SEQ ID NO:163 nukleotiididest 64 kuni 13. Küps polüpeptiid koosneb järjestuse SEQ ID NO:164 aminohappejääkidest 2 (His) kuni 13 (Ser); järjestuse SEQ ID NO:163 nukleotiididest 136 kuni 22. Inimese IL-4 heeliks A koosneb järjestuse SEQ ID NO:164 aminohappejääkidest (Thr) kuni 42 (Thr); järjestuse SEQ ID NO:163 nukleotiididest 11 kuni 189. Inimese IL-4 heeliks B koosneb järjestuse SEQ ID NO:164 aminohappejääkidest 6 (Glu) kuni 83 (His); järjestuse SEQ ID NO:163 nukleotiididest 26 kuni 312. Inimese IL-4 heeliks C koosneb järjestuse SEQ ID NO:164

19 17 1 aminohappejääkidest 94 (Ala) kuni 118 (Ala); järjestuse SEQ ID NO:163 nukleotiididest 343 kuni 417. Inimese IL-4 heeliks D koosneb järjestuse SEQ ID NO:164 aminohappejääkidest 133 (Leu) kuni 11 (Cys) ; järjestuse SEQ ID NO: 163 nukleotiididest 460 kuni 16. Inimese GM-CSF polünukleotiidne järjestus on näidatud järjestuses SEQ ID NO:16 ja vastav aminohappeline järjestus on näidatud järjestuses SEQ ID NO: 166. Sekretoorne signaaljärjestus koosneb järjestuse SEQ ID NO:166 aminohappejääkidest 1 (Met) kuni 17 (Ser); järjestuse SEQ ID NO:16 nukleotiididest 9 kuni 9. Küps polüpeptiid koosneb järjestuse SEQ ID NO:166 aminohappejääkidest 18 (Ala) kuni 144 (Glu); järjestuse SEQ ID NO:16 nukleotiididest 60 kuni 440. Inimese GM-CSF heeliks A koosneb järjestuse SEQ ID NO:166 aminohappejääkidest (Trp) kuni 44 (Asn); järjestuse SEQ ID NO:16 nukleotiididest 96 kuni 140. Inimese GM-CSF heeliks B koosneb järjestuse SEQ ID NO:166 aminohappejääkidest 72 (Leu) kuni 81 (Gln); järjestuse SEQ ID NO:16 nukleotiididest 222 kuni 21. Inimese GM-CSF heeliks C koosneb järjestuse SEQ ID NO:166 aminohappejääkidest 8 (Gly) kuni 3 (Gln); järjestuse SEQ ID NO:16 nukleotiididest 261 kuni 317. Inimese GM-CSF heeliks D koosneb järjestuse SEQ ID NO:166 aminohappejääkidest 1 (Phe) kuni 131 (Leu); järjestuse SEQ ID NO:16 nukleotiididest 366 kuni 401. Inimese zcytor17lig, IL-3, IL-2, IL-4 ja GM-CSF aminohappelised järjestused, mis sisaldavad heelikseid A, B, C ja D, on näidatud tabelis 1. Tabel 1 Heeliks Heeliks Heeliks C Heeliks A B D zcytor17lig Järjestus SEQ ID NO:2 IL Järjestus SEQ ID NO: 2 IL Järjestus SEQ ID NO:162; või heeliks B, nagu on kirjeldatud

20 18 Heeliks Heeliks Heeliks C Heeliks A B D järjestuses SEQ ID NO:168 IL-4 GM Järjestus SEQ ID NO: 164 of CSF SEQ ID NO: Käesolevas patendikirjelduses kirjeldatakse polünukleotiidide molekule, sealhulgas DNA ja RNA molekule, mis kodeerivad käesolevas dokumendis avaldatud zcytor17lig polüpeptiide. Asjatundjad mõistavad kiiresti, et geneetilise koodi kõdumise tõttu võib sellistel polünukleotiidse molekulide seas esineda olulisel määral järjestuste variatsioone. SEQ ID NO:3 on kõdunud DNA järjestus, mis sisaldab kõiki DNA-sid, mis kodeerivad zcytor17lig polüpeptiidi ja selle fragmente, mis vastavad järjestusele SEQ ID NO:2. Asjatundjad mõistavad, et kõdunud järjestus SEQ ID NO:3 tagab ka kõik RNA järjestused, mis kodeerivad järjestust SEQ ID NO:2, kui asendada T Uga. Seega on käesolev leiutise seotud zcytor17lig polüpeptiidi kodeerivate polünukleotiididega, mis koosnevad järjestuste SEQ ID NO:3 nukleotiidist 1 või 70 kuni 492, ja nende RNA ekvivalentidest. Tabelis 2 on toodud ühetähelised koodid, millega tähistatakse järjestuses kõdunud nukleotiidide positsioone. Resolutsioonid on tähekoodiga tähistatud nukleotiidid. Komplement on komplementaarsete nukleotiidide kood. Näiteks kood Y on kas C või T ja selle komplement R on A või G, kusjuures A on komplementaarne T suhtes ja G on komplementaarne C suhtes. Tabel 2 Nukleotiid Resolutsioon Komplement Resolutsioon A A T T C C G G G G C C T T A A

21 19 Nukleotiid Resolutsioon Komplement Resolutsioon R A G Y C T Y C T R A G M A C K G T K G T M A C S C G S C G W A T W A T H A C T D A G T B C G T V A C G V A C G B C G T D A G T H A C T N A C G T N A C G T SEQ ID NO:3-s kasutatud kõdunud koodonid, mis hõlmavad kõiki antud aminohappele vastavaid koodoneid, on esitatud tabelis 3. Tabel 3 Aminohape Ühetäheline kood Koodonid Kõdunud koodon Cys C TGC TGT TGY Ser S AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN Thr T ACA ACC ACG ACT ACN Pro P CCA CCC CCG CCT CCN Ala A GCA GCC GCG GCT GCN Gly G GGA GGC GGG GGT GGN Asn N AAC AAT AAY

22 Aminohape Ühetäheline kood Koodonid Kõdunud koodon Asp D GAC GAT GAY Glu E GAA GAG GAR Gln Q CAA CAG CAR His H CAC CAT CAY Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN Lys K AAA AAG AAR Met M ATG ATG Ile I ATA ATC ATT ATH Leu L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN Val V GTA GTC GTG GTT GTN Phe F TTC TTT TTY Tyr Y TACTAT TAY Trp W TGG TGG Ter. TAA TAG TGA TRR Asn Asp B RAY Glu Gln Z SAR Mis tahes X NNN Asjatundjad mõistavad, et kõdunud koodoni, mis vastab kõigile võimalikele igat aminohapet kodeerivatele koodonitele, määramine on mõningal määral mitmetähenduslik. Näiteks seriini kõdunud koodon (WSN) võib mõnedel asjaoludel kodeerida arginiini (AGR) ja arginiini kõdunud koodon võib mõnedel asjaolusel kodeerida seriini (AGY). Sarnane seos on fenüülalaniini ja leutsiini kodeerivate koodonite vahel. Seega võivad mõned kõdunud järjestusega seotud polünukleotiidid kodeerida aminohappeliste järjestuste variante, kuid asjatundjad oskavad selliseid järjestuste variante aminohappelise

23 21 järjestuse SEQ ID NO:2 abil kergesti määrata. Järjestuste variantide funktsionaalsust saab käesolevas dokumendis kirjeldataval viisil hõlpsasti testida. 1 2 Asjatundjad mõistavad ka seda, et erinevatel liikidel võib olla eelistav koodoni kasutus (preferential codon usage). Vt üldteavet allikast Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8: , 1980; Haas, et al. Curr. Biol. 6:31-24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13:3-64, 1981; Grosjean and Fiers, Gene 18:199-9, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14:7-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 18:73-97, Käesolevas dokumendis on eelistatav koodoni kasutus või eelistatavad koodonid erialane termin, millega tähistatakse valku transleerivad koodonid, mida kasutatakse sageli teatud liikide rakkudes, eelistades igat aminohapet kodeerivate võimalike koodonite üht või mitut esindajat (vt tabelit 3). Näiteks aminohapet treoniin (Thr) võib kodeerida ACA, ACC, ACG või ACT, kuid imetajarakkudes kasutatakse koodonina kõige sagedamini ACC-d, teiste liikide korral ehk näiteks putuka-, pärmi-, viiruse- või bakterirakkudes võivad olla eelistavad teistsugused Thr koodonid. Konkreetse liigi eelistavad koodonid saab sisestada käesoleva leiutise kohastesse polünukleotiididesse paljudel tehnika tasemes tuntud meetoditel. Eelistavate koodonjärjestuste sisestamise teel rekombinantsesse DNA-sse saab näiteks muuta valgu translatsiooni teatud tüüpi või liigi rakkudes efektiivsemaks ja intensiivistada seeläbi valgu tootmist. Järjestuses SEQ ID NO:3 avaldatud kõdunud koodonjärjestust kasutatakse seega tehnika tasemes kasutatavas ja käesolevas dokumendis avaldatud erinevat tüüpi ja liiki rakkudes polünukleotiidide ekspresseerimisel matriitsina. Eelistatavaid koodoneid sisaldavaid järjestusi saab ekspresseerimise ja funktsionaalsuse osas testida ja optimeerida erinevate liikide rakkudes käesolevas dokumendis kirjeldataval viisil. Nagu on märgitud eespool, kuuluvad selles dokumendis kirjeldatavate polünukleotiidide hulka DNA ja RNA. DNA ja RNA valmistusmeetodid on tehnika tasemes hästi tuntud. RNA üldjuhul isoleeritakse koest või rakust, mis toodab suures koguses zcytor17lig RNAd. Sellised koed ja rakud määratakse Northern blot meetodil (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1, 1980) või erinevatest rakutüüpidest valmistatud konditsioneeritud söötme skriinimise teel sihtrakkudele või koele avalduva toime osas. Pärast kõnealuse toime või RNA-d tootva raku või koe määramist saab guanidiinisotiotsüanaadiga

24 22 ekstraheerimise ja sellele järgneva CsCl gradiendis tsentrifuugides isoleerimise teel valmistada kogu-rna (Chirgwin et al., Biochemistry 18:2-94, 1979). Poly (A) + RNA valmistatakse kogu-rna-st meetodil, mida kirjeldavad Aviv and Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: , 1972). Komplementaarne DNA (cdna) valmistatakse poly(a) + RNA-st tuntud meetoditel. Selle asemel võib isoleerida genoomse DNA. Seejärel määratakse polünukleotiidid, mis kodeerivad zcytor17lig polüpeptiide ja isoleeritakse need näiteks hübridiseerimise teel või PCR-meetodil. 1 zcytor17lig-i kodeeriva täispika klooni saab valmistada tavapäraste kloonimisprotseduuride abil. Eelistatud on komplementaarse DNA (cdna) kloonid, kuid mõnes rakenduses (nt transgeensete loomade organismis ekspresseerimisel) võib olla eelistatud genoomne kloon või cdna kloon, mida on modifitseeritud vähemalt ühe genoomse introni sisestamise teel. cdna ja genoomsete kloonide valmistusmeetodid on hästi tuntud ja asjatundjatele selged ning nende hulka kuulub panga sondeerimine või praimimine käesolevas dokumendis avaldatud järjestuse või selle osadega. Ekspressioonipanku saab sondeerida zcytor17lig fragmentide vastaste antikehade, zcytor17-hõlmavate lahustuvate retseptorite vastaste antikehade või teiste spetsiifiliste seondumispartneritega. 2 Käesolevas dokumendis kirjeldatavaid zcytor17lig polünukleotiidseid järjestusi saab kasutada sondide või praimeritena zcytor17lig geeni ' mittekodeerivate piirkondade kloonimisel. Arvestades zcytor17lig puhul täheldatud koespetsiifilist ekspresseerimist, tagab see geeni piirkond eeldustekohaselt hematopoeetiliste ja lümfirakkude-spetsiifilise ekspresseerimise. zcytor17lig geeni promootorelementide abil saab seega suunata heteroloogiliste geenide koespetsiifilist ekspresseerimist transgeensetel loomadel või geeniteraapiat saavatel patsientidel. ' külgnevate järjestuste kloonimise teel saab hõlbustada ka zcytor17lig valkude tootmist geeni aktiveerimise teel, nagu kirjeldatakse USA patendis nr,641,670. Lühidalt, selleks et muuta endogeense zcytor17lig geeni ekspressiooni rakus, sisestatakse zcytor17lig lookusesse DNA konstrukt, mis sisaldab vähemalt sihtimisjärjestust, regulatoorset järjestust, eksonit ja paardumata splaissimise doonorsaiti. Sihtimisjärjestus on zcytor17lig ' mittekodeeriv järjestus, mis võimaldab konstruktil homoloogiliselt rekombineeruda endogeense zcytor17lig lookusega, mille

25 tulemusena seotakse järjestused konstruktis funktsionaalselt endogeenset zcytor17lig kodeeriva järjestusega. Sellisel viisil saab endogeense zcytor17lig promootori asendada või seda täiendada teiste regulatoorsete järjestustega ja tagada intensiivsema koespetsiifilise või muul viisil reguleeritud ekspressiooni. Käesolevas patendikirjelduses kirjeldatakse teistelt liikidelt pärinevaid samaväärseid polüpeptiide ja polünukleotiide (ortolooge). Selliste liikide hulka kuuluvad näiteks, kuid mitte ainult, imetaja-, linnu-, kahepaikse-, roomaja-, kala-, putuka- ja teiste selgroogsete ja selgrootute liigid. Eriti huvipakkuvad on zcytor17lig polüpeptiidid, mis pärinevad teistelt imetajaliikidelt, sealhulgas näiteks hiire, sea, lamba, veise, koera, kassi, hobuse ja teiste primaatide polüpeptiidid. Inimese zcytor17lig ortolooge saab kloonida käesoleva leiutisega pakutud teabe ja kompositsioonide ning tavapäraste kloonimismeetodite kombinatsiooniga. cdna-d näiteks saab kloonida mrna-ga, mis pärineb siin kirjeldataval viisil zcytor17lig ekspresseerivast koe- või rakutüübist. Sobivad mrna allikad saab määrata Northern blot meetodil sondidega, mis on konstrueeritud käesolevas dokumendis avaldatud järjestustest. Seejärel valmistatakse positiivsest koe või rakuliini mrna-st pank. Seejärel saab mitmesugustel meetoditel nagu sondeerimine tervikliku või osalise inimese cdna-ga või avaldatud järjestustel põhineva ühe või mitme kõdunud sondide ühikuga (set). cdna-d saab kloonida ka polümeraasi ahelreaktsiooniga ehk PCRmeetodil (Mullis, USA patent nr ) praimeritega, mis on konstrueeritud käesolevas dokumendis avaldatud inimese zcytor17lig järjestusest. Ühe lisameetodi korral saab cdna panga abil transformeerida või transfekteerida peremeesrakke ja tuvastada zcytor17lig polüpeptiidi vastase antikeha, seonduvusuuringute või aktiivsuse katsete abil huvipakkuva cdna ekspressiooni. Sarnaseid meetodeid saab kasutada ka genoomsete kloonide isoleerimiseks. zcytor17lig hiire ortoloogi polünukleotiidne järjestus on identifitseeritud ja näidatud järjestuses SEQ ID NO: ja SEQ ID NO:90 ning vastav aminohappeline järjestus on näidatud järjestuses SEQ ID NO:11 ja SEQ ID NO:91. Kõdunud polünukleotiidne järjestus, mis kodeerib polüpeptiidi järjestusega SEQ ID NO:11, on näidatud järjestuses SEQ ID NO:12. zcytor17lig hiire tsütokiini aminohappelise järjestuse puhul määravad ennustuste kohaselt heeliksi A aminohappejäägid 38-2, heeliksi B aminohappejäägid 8-

26 24 98, heeliksi C aminohappejäägid ja heeliksi D aminohappejäägid , nagu on näidatud järjestustes SEQ ID NO:11 ja SEQ ID NO:91. Hiire ja inimese järjestused on zcytor17lig aminohappeliste järjestuste (SEQ ID NO:2 ja SEQ ID NO:11) kogu pikkust arvestades 31% ulatuses identsed. Hiire zcytor17lig küps järjestus oletatavasti algab järjestuses SEQ ID NO:11 näidatud aminohappejäägiga Met 1, mis vastab järjestuses SEQ ID NO:2 näidatud inimese järjestuse aminohappejäägile Met 1. Koeanalüüs näitas, et hiire zcytor17lig-d ekspresseeritakse munandites, ajus, CD90+ rakkudes, eesnäärmerakkudes, süljenäärmetes ja nahas. 293T rakkudest isoleeritud zcytor17lig edasine N-otsa sekveneerimisanalüüs näitas, et N-ots paikneb aminohappejäägi 31 (Ala) juures, nagu on näidatud järjestuses SEQ ID NO:11 ja SEQ ID NO:91, ja et küps polüpeptiid koosneb aminohappejääkidest 31 (Ala) kuni 163 (Cys) (nagu on näidatud järjestustes SEQ ID NO: 11 ja SEQ ID NO:91). 1 2 Asjatundjad mõistavad, et järjestuses SEQ ID NO:1 avaldatud järjestus vastab inimese zcytor17lig üksikule alleelile ja et võib eeldada alleelsete variantide ja alternatiivse splaissimise esinemist. Selle järjestuse alleelseid variante saab kloonida eri indiviididelt pärinevate cdna või genoomsete pankade sondeerimise teel standardsete protseduuride abil. Käesoleva leiutise ulatusse kuuluvad järjestuses SEQ ID NO:1 näidatud DNA järjestuse alleelsed variandid, sealhulgas variandid, mis sisaldavad vaikseid mutatsioone, ja variandid, milles on aminohappeline järjestus mutatsioonide tulemusena muutunud, ja ka valgud, mis on SEQ ID NO:2 alleelsed variandid. Käesolevas dokumendis kirjeldatakse cdna-sid, mis on valmistatud alternatiivselt splaissitud mrna-dest, mis säilitavad zcytor17lig polüpeptiidi omadused, ja ka selliste cdna-de ja mrna-de poolt kodeeritavaid polüpeptiide. Selliste järjestuste alleelseid variante ja splaiss-variante saab kloonida eri indiviididelt või kudedest pärinevate cdna või genoomsete pankade sondeerimise teel tehnika tasemes tuntud standardsete protseduuride abil. Käesolevas patendikirjelduses kirjeldatakse reagente, mida saab kasutada diagnostilistes rakendustes. Näiteks zcytor17lig geeniga, sondiga, mis sisaldab zcytor17lig DNA-d või RNA-d või selle alamjärjestust saab määrata, kas inimese kromosoom nagu 12. kromosoom sisaldab zcytor17lig geeni või on toimunud geenimutatsioon. Zcytor17lig paikneb 12. kromosoomi 12q24.31 piirkonnas (näide 13). Kromosoomaberratsioonid,