UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO NIKA KRULJEC MAGISTRSKA NALOGA ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJE

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO NIKA KRULJEC MAGISTRSKA NALOGA ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJE Ljubljana, 2014

2

3 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO NIKA KRULJEC NAČRTOVANJE IN PRIPRAVA MODELNEGA REKOMBINANTNEGA PROTEINA, OZNAČENEGA S STREPTAVIDIN-VEZAVNIM PEPTIDOM DESIGN AND PREPARATION OF A MODEL RECOMBINANT PROTEIN, LABELED WITH STREPTAVIDIN-BINDING PEPTIDE ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJE Ljubljana, 2014

4 Magistrsko delo sem opravljala na Katedri za farmacevtsko biologijo Fakultete za farmacijo pod mentorstvom doc. dr. Tomaţa Bratkoviča. Določitev nukleotidnih zaporedij molekul DNA so izvedli v podjetju GATC Biotech AG (Konstanz, Nemčija), določitev aminokislinskega zaporedja pa so opravili na Inštitutu Joţefa Stefana, Ljubljana. ZAHVALA Iskreno se zahvaljujem svojemu mentorju doc. dr. Tomaţu Bratkoviču za vso posredovano znanje in izkušnje, koristne nasvete in pomoč pri nastajanju te naloge ter dragoceno podporo. Posebna zahvala gre Petru Moleku za vso pomoč pri delu, dostopnost, potrpeţljivost pri reševanju praktičnih problemov ter prijetno druţbo v laboratoriju. Zahvaljujem se tudi doc. dr Alešu Berlecu, ki je opravil določitev aminokislinskega zaporedja. Posebna zahvala gre tudi moji druţini za podporo in razumevanje in vsem, ki so verjeli vame. IZJAVA Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom doc.dr. Tomaţa Bratkoviča. Ljubljana, september 2014 Predsednik komisije: prof. dr. Danijel Kikelj Član komisije: asist. dr. Vid Mlakar

5 Kazalo vsebine KAZALO SLIK... iii POVZETEK... iv ABSTRACT... v SEZNAM OKRAJŠAV... vi KRATICE IN OKRAJŠAVE ZA AMINOKISLINE... vii 1. UVOD PROTEINSKO INŢENIRSTVO Različni pristopi proteinskega inţenirstva FUZIJSKI PROTEINI Peptidne oznake STREPTAVIDIN-BIOTIN AFINITETNA KROMATOGRAFIJA TEHNOLOGIJA FRET NAMEN NALOGE MATERIALI IN METODE MATERIALI Kemikalije Biološki material Pufri, raztopine, gojišča, geli Laboratorijska oprema in ostali material METODE Načrtovanje kloniranja Nano-tag(9) v vektorski sistem pet-28/b_insert Molekulsko kloniranje Delo z bakterijami Izolacija, čiščenje in analiza proteina Kemijska modifikacija proteina SHEMA POTEKA EKSPERIMENTALNEGA DELA SHEMA PRIPRAVE EKSPRESIJSKEGA VEKTORJA SHEMA IZRAŢANJA, IZOLACIJE IN ČIŠČENJAREKOMBINANTNEGA PROTEINA SHEMA POTEKA POSKUSOV KEMIJSKEGA MODIFICIRANJA REKOMBINANTNEGA PROTEINA Nano-tag(9)-rBd i

6 5. REZULTATI IN RAZPRAVA Načrtovanje kloniranja Nano-tag(9) v ekspresijski sistem pet-28/b_insert Virtualno kloniranje Molekulsko kloniranje Restrikcija pet-28/b_insert z restrikcijskima endonukleazama NcoI in SacII Določitev nukleotidnega zaporedja Testno izraţanje proteina Izraţanje in izolacija rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd Določitev N-končnega zaporedja proteina Preverjanje funkcionalnosti Nano-tag(9)-rBd Kemijska modifikacija proteina SKLEP VIRI IN LITERATURA PRILOGE Priloga 1: Genska karta izhodnega plazmida pet Priloga 2: Nukleotidno zaporedje izhodnega plazmida pet-28/b_insert Priloga 3: Prikaz rezultatov določitve N-končnega aminokislinskega zaporedja proteina Nanotag(9)-rBd z Edmanovo degradacijo. Desno spodaj je podan kromatogram aminokislinskih standardov ii

7 KAZALO SLIK SLIKA 1: OSNOVNI PRINCIP TESTOV NA OSNOVI INTERAKCIJE (STREPT)AVIDIN-BIOTIN [17]. 6 SLIKA 2: PRENOS RESONANČNE ENERGIJE Z DONORSKE NA AKCEPTORSKO MOLEKULO [20]. 9 SLIKA 3: STRUKTURA FLUORESCENTNEGA BARVILA TAMRA IN AKCEPTORSKE MOLEKULE QSY-7 [24]. 10 SLIKA 4: PREDSTAVITEV NAČRTOVANEGA SISTEMA FRET. 12 SLIKA 5: SHEMATSKI PRIKAZ VEZAVE REKOMBINANTNEGA PROTEINA S POLIHISTIDINSKIM REPKOM NA NOSILEC NI 2+ -NTA. 28 SLIKA 6: PREDSTAVITEV PREDVIDENE STRUKTURE REKOMBINANTNEGA PROTEINA NANO-TAG(9)-RBD [35]. S PUŠČICO JE OZNAČENO MESTO PRIPENJANJA AFINITETNEGA PODALJŠKA NANO-TAG(9). 41 SLIKA 7: SLIKA AGAROZNEGA GELA PO RESTRIKCIJI PET-28/B_INSERT Z RESTRIKCIJSKIMA ENDONUKLEAZAMA NCOI IN SACII. 42 SLIKA 8: SLIKA AGAROZNEGA GELA PO REAKCIJI PCR NA OSNOVI KOLONIJE. 43 SLIKA 9: SLIKA LOČBE CELIČNIH PROTEINOV NA GELU S NADS-PAGE PO TESTNEM IZRAŢANJU. BARVANJE S COOMASSIE MODRIM. 45 SLIKA 10: NITROCELULOZNA MEMBRANA PO PRENOSU WESTERN IN DETEKCIJI REKOMBINANTNEGA PROTEINA S PRIMARNIMI PROTITELESI ANTIHIS. 46 SLIKA 11: REZULTATI VEZAVE SA-HRP NA CELIČNE LIZATE PO TESTNEM IZRAŢANJU 47 SLIKA 12: SLIKA PREDSTAVLJA KROMATOGRAM POTEKA ČIŠČENJA NANO-TAG(9)-RBD S KROMATOGRAFIJO IMAC. 48 SLIKA 13: ANALIZA IZBRANIH FRAKCIJ PO ČIŠČENJU Z IMAC Z NADS-PAGE. GEL SMO BARVALI S COOMASSIE MODRIM. PUŠČICE OZNAČUJEJO LISE, KI PRIPADAJO REKOMBINANTNEMU PROTEINU NANO-TAG(9)-RBD. 48 SLIKA 14: REPREZENTATIVEN KROMATOGRAM ČIŠČENJA REKOMBINANTNEGA PROTEINA NANO-TAG(9)-RBD Z GELSKO FILTRACIJO. 49 SLIKA 15: POLIAKRILAMIDNI GEL PO NADS-PAGE IN BARVANJU S COOMASSIE MODRIM: ANALIZA ČISTOSTI POSAMEZNIH FRAKCIJ PO GELSKI FILTRACIJI. 50 SLIKA 16: REZULTATI PREVERJANJA FUNKCIONALNOSTI FUZIJSKIH PARTNERJEV PROTEINA NANO-TAG(9)-RBD Z ENCIMSKO-IMUNSKIM TESTOM (ELISA 2). 51 SLIKA 17: PREVERJANJE FUNKCIONALNOSTI REKOMBINANTNEGA PROTEINA S TOČKOVNIM NANOSOM (TOČKOVNI NANOS 1). 52 SLIKA 18: PREVERJANJE SPOSOBNOSTI VEZAVE SA-HRP NA NANO-TAG(9)-RBD S TOČKOVNIM NANOSOM PO FORMILIRANJU Z REAGENTOM TFEF V RAZTOPINI. 54 SLIKA 19: PREVERJANJE SPOSOBNOSTI VEZAVE NANO-TAG(9)-RBD NA SA-HRP Z ENCIMSKO-IMUNSKIM TESTOM (ELISA 3). 56 SLIKA 20: REZULTATI PREVERJANJA FUNKCIONALNOSTI NANO-TAG(9)-RBD Z ENCIMSKO-IMUNSKIM TESTOM (ELISA 4). 57 iii

8 POVZETEK Z napredkom na področju biokemijskih znanosti vsakodnevno odkrivajo nove proteine in peptide, s čimer se povečuje potreba po razvoju novih tehnologij za kvalitativno in kvantitativno vrednotenje potencialnih medmolekulskih interakcij. Ena izmed pomembnejših metod za detekcijo in vrednotenje interakcij med biološkimi molekulami je tehnologija prenosa energije z resonanco fluorescence (FRET). Namen magistrske naloge je bil vzpostaviti modelni test za detekcijo ligandov streptavidina s pomočjo tehnologije FRET, pri čemer smo načrtovali ter pripravili modelni fuzijski protein, zgrajen iz nosilnega proteina (domena B stafilokoknega proteina A) in peptidnega liganda streptavidina (t.i. Nano-tag(9)). Genski konstrukt smo načrtovali tako, da smo na N-konec domene B stafilokoknega proteina A uvedli aminokislinsko zaporedje afinitetnega podaljška Nano-tag(9). Konstrukt smo vnesli v ekspresijski plazmid pet-28 ter izrazili v Escherichia coli. Izraţeni rekombinantni fuzijski protein smo očistili s kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo (IMAC) ter gelsko filtracijo. Potrditev identitete rekombinantnega proteina smo dosegli z metodo Edmanove degradacije, s katero smo določili prvih pet N-končnih aminokislin. Z encimsko-imunskimi testi (ELISA), točkovnimi nanosi ter prenosom western nismo mogli potrditi pričakovane vezave afinitetnega podaljška Nano-tag(9) v izraţenem rekombinantnem proteinu Nano-tag(9)-rBd na streptavidin. Sklepali smo, da je vzrok v odsotnosti formilne skupine z N-končne aminske skupine afinitetnega podaljška, zaradi česar smo izraţeni rekombinatni protein skušali kemijsko formilirati. Formiliranje smo izvedli z reagentom 2,2,2-trifluoroetilformat (TFEF) v N,N-dimetilformamidu. S testom ELISA smo potrdili sposobnost vezave modificiranega proteina Nano-tag(9)-rBd na streptavidin, a ker je reakcija formiliranja potekala v organskem topilu in neselektivno (verjetno je formiliranje potekalo tudi na ostalih aminskih skupinah), je prišlo do porušenja nativne strukture nosilnega proteina. iv

9 ABSTRACT The ever faster progress in the field of biochemistry leads to discovery of new proteins and peptides on a daily basis, increasing the need for development of new technologies for qualitative and quantitative evaluation of potential molecular interactions. One of the most important approaches for the detection and evaluation of interactions between biological molecules relies on fluorescence resonance energy transfer (FRET) phenomenon. The purpose of this master's degree thesis was to establish a model test for detection of ligands of streptavidin by using FRET technology. This included design and preparation of a model fusion protein built from a carrier protein (B domain of staphylococcal protein A) and a streptavidin-binding peptide (i.e. Nano-tag(9)). Gene encoding the fusion protein was constructed by introducing the streptavidin affinity tag upstream of the staphylococcal protein A B domain gene. The construct was subcloned into pet-28 expression plasmid and the encoded recombinant protein was expressed in Escherichia coli. The recombinant protein was purified by immobilized metal-ion affinity chromatography (IMAC) and gel filtration. The identity of recombinant product was confirmed by Edman's degradation technique used to determine five N-terminal amino acids. Using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), dot blot or western blot, we were unable to confirm the expected interaction of the Nano-tag(9) affinity tag in recombinant fusion protein with streptavidin. To test whether this was due to absence of formyl group on the N-terminal amino group of affinity tag, we tried to chemically modify the recombinant product. Formylation of the recombinant protein Nano-tag(9)-rBd was carried out with 2,2,2- trifluoroethyl formate in N,N-dimethylformamide. Using enzyme-linked immunosorbent assay, we confirmed the binding of the formylated protein Nano-tag(9)-rBd to streptavidin, however, the carrier protein did not retain its native structure due to the harsh formylation conditions. v

10 SEZNAM OKRAJŠAV B-BSA biotiniliran goveji serumski albumin (ang. bovine serum albumin ) B-hLEP biotiniliran humani leptin BSA goveji serumski albumin (ang. bovine serum albumin ) B-SpA domena B stafilokoknega proteina A ddh 2 O bidestilirana voda DNA deoksiribonukleinska kislina ELISA encimsko-imunski test (ang. enzyme-linked immunosorbent assay ) HRP hrenova peroksidaza (ang. horseradish peroxidase ) IMAC kovinsko-kelatna afinitetna kromatografija (ang. immobilized metal-ion affinity chromatography ) IPTG izopropil-tio- -D-galaktopiranozid, induktor promotorja lac (k)bp (kilo)bazni par, enota za velikost DNA LB bakterijsko gojišče (ang. lysogeny broth ) mab monoklonsko protitelo NaDS natrijev dodecilsulfat OD 600 PAGE PBS optična gostota pri 600 nm (ang. optical density ) poliakrilamidna gelska elektroforeza fosfatni pufer s soljo (ang. phosphate-buffered saline ) PBST fosfatni pufer s soljo z dodanim polisorbatom-20 (Tween 20) PCR veriţna reakcija s polimerazo (ang. polymerase chain reaction ) SA-HRP konjugat streptavidina s hrenovo peroksidazo SpA stafilokokni protein A TFEF 2,2,2-trifluoroetilformat TMB 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin vrt./min število vrtljajev na minuto X-gal 5-bromo-4-kloro-3-indolil- -D-galaktopiranozid, substrat za - galaktozidazo vi

11 KRATICE IN OKRAJŠAVE ZA AMINOKISLINE A Ala alanin R Arg arginin N Asn asparagin D Asp asparaginska kislina C Cys cistein Q Gln glutamin E Glu glutaminska kislina G Gly glicin H His histidin I Ile izolevcin L Leu levcin K Lys lizin M Met metionin F Phe fenilalanin P Pro prolin S Ser serin T Thr treonin W Trp triptofan Y Tyr tirozin V Val valin vii

12 1. UVOD 1.1. PROTEINSKO INŢENIRSTVO Proteinsko inţenirstvo predstavlja vse aktivnosti, povezane z načrtovanjem in spreminjanjem obstoječih proteinov ter ustvarjanje proteinov z izboljšanimi ali popolnoma novimi lastnostmi. Zahvaljujoč razvoju tehnologije rekombinantne DNA imamo moţnost tako spreminjanja aminokislinskega zaporedja proteina kot tudi delecij ali insercij novih aminokislinskih regij v proteinu. Osnova proteinskega inţenirstva temelji na dejstvu, da primarna struktura proteina (aminokislinsko zaporedje) določa konformacijo polipeptidne verige, pri čemer se moramo zavedati, da vsak aminokislinski ostanek potencialno vpliva na končno tridimenzionalno strukturo proteina, njegovo stabilnost ter funkcionalnost [1]. Proteinsko inţenirstvo najpogosteje uporabljamo za uvajanje novih/dodatnih funkcij v proteine, povečanje afinitete in specifičnosti vezave (terapevtskih) proteinov, spreminjanje farmakokinetičnih lastnosti terapevtskih proteinov, povečanje stabilnosti in/ali topnosti proteinov, odstranitev odvečnih regij v proteinu in odkrivanje novih peptidnih ali proteinskih spojin vodnic. Posamezen namen doseţemo na različne načine: z delecijo, insercijo, zamenjavo ali spremembo aminokislinskih ostankov ali s kombinacijo vseh naštetih sprememb [2] Različni pristopi proteinskega inţenirstva Glede na zasnovo projekta razlikujemo dva osnovna pristopa, racionalno načrtovanje (ang. rational design) in usmerjeno evolucijo (ang. directed evolution), pri čemer se uporaba obeh metod velikokrat prepleta pri načrtovanju in razvoju novih proteinov. Pri obeh metodah delo poteka v treh korakih: (i) načrtovanje spremembe, (ii) mutageneza in (iii) vrednotenje novo nastalih proteinov [3] Racionalno načrtovanje Metoda racionalnega načrtovanja je primerna predvsem za proteine z dobro poznano strukturo in delovanjem. Načrtovanje spremembe (lokacija in vrsta spremembe) je najpomembnejši korak pri pristopu racionalnega načrtovanja, saj zahteva natančno poznavanje strukture proteina (npr. prostorsko strukturo in konformacijo nativnega proteina, identifikacijo ključnih mest, udeleţenih v interakcije z naravnimi ligandi ali substrati). Na podlagi teh informacij lahko uvedemo vnaprej določene (izbrane) spremembe na točno določena mesta v proteinu. 1

13 Načrtovano mutagenezo proteinov lahko izvedemo s kemijsko sintezo peptidnih fragmentov na ustreznih nosilcih ali v raztopini, vendar jo zaradi dolţine polipeptidne verige in kompleksne strukture proteinov največkrat izvajamo na nivoju DNA. Pri tem uporabljamo veriţno reakcijo s polimerazo (ang. polymerase chain reaction) z delno prilegajočimi se začetnimi oligonukleotidi ali kasetno mutagenezo. Spremenjen genski konstrukt vstavimo v ustrezen ekspresijski vektor, ki ga vnesemo v izbrane gostiteljske celice za izraţanje. V tretji fazi ovrednotimo lastnosti novega proteina [3]. K razvoju racionalnega načrtovanja je pripomogel predvsem razvoj tehnik za določanje prostorske strukture, kot sta rentgenska kristalografija in jedrna magnetna resonanca (NMR), vzpostavitev bioinformacijskih podatkovnih baz ter razvoj tehnik usmerjene mutageneze. Načrtovane spremembe vstavimo v gen s pomočjo usmerjene mutageneze, kar lahko doseţemo na dva načina. Prvi pristop je klasična usmerjena mutageneza, ki sloni na uporabi oligonukleotida z eno ali več nukleotidnimi spremembami na točno določenem mestu. Takšen začetni oligonukleotid se, kljub nekomplementarnemu krajšemu odseku, specifično poveţe z matrično molekulo DNA in podaljša z DNA-polimerazo v reakciji PCR. Kot matrično molekulo uporabimo gen, vstavljen v vektor, in s tem je nova veriga popolnoma komplementarna matrični molekuli z izjemo na mestu, kamor smo ţeleli vnesti spremembo (govorimo o heterodupleksu). Ustvarjen heterodupeks vstavimo v gostiteljsko celico (praviloma bakterijo Escherichia coli), ki v enakem razmerju pomnoţi mutiran in nemutiran gen, čemur sledi selekcija kolonij, ki vsebujejo mutirani gen. Drugi pristop usmerjene mutageneze je novejši in ga izvajamo samo s pomočjo PCR. Uporabimo dva med seboj komplementarna začetna oligonukleotida, pri čemer se njuno zaporedje v osrednjem delu razlikuje od zaporedja izvornega gena. V dveh ločenih reakcijah PCR pomnoţimo oba konca izbranega gena z ustreznimi pari začetnih oligonukleotidov. Eden iz para se popolnoma prilega določenemu koncu matrične molekule DNA, drugi pa se v območju, kamor ţelimo vnesti spremembe, delno prilega matrični DNA. Kot produkt mutageneze dobimo prekrivajoča se segmenta DNA z uvedeno mutacijo. Amplikona primarnih reakcij PCR izoliramo, zdruţimo, denaturiramo in poveţemo v sekundarni reakciji PCR z robnima začetnima oligonukleotidoma. Večinski produkt te reakcije so mutirane različice gena, zaradi česar ločevanje mutiranih in nemutiranih klonov ni potrebno. Dodatno prednost predstavlja tudi delo z izoliranimi, linearnimi fragmenti, pri čemer ni potrebno predhodno kloniranje gena v ustreznem ekspresijskem vektorju [4]. 2

14 Usmerjena evolucija Kljub temu da je princip racionalnega načrtovanja uspešno privedel do razvoja novih proteinov, se je pojavila potreba po principu, ki bi omogočil tudi spreminjanje proteinov, pri katerih odnos med strukturo in funkcijo ni dobro poznan - to je princip t.i. usmerjene evolucije. Princip temelji na naključnem vnašanju sprememb v strukturo proteina, npr. z uporabo PCR, podvrţene napakam (ang. error-prone PCR) ali pomnoţevanju gena v bakterijskih sevih, ki pogosteje vnašajo mutacije. Na tak način pripravimo veliko število različic izvornega proteina (med njimi je sicer veliko nefunkcionalnih), ki predstavljajo knjiţnico. Iz celotnega nabora knjiţnice s presejalnimi testi (npr. afinitetnimi selekcijami) identificiramo proteine z ţelenimi lastnostmi ter izoliramo gene, ki jih kodirajo [5] FUZIJSKI PROTEINI Fuzijski ali himerni proteini so proteini, prevedeni z genov, nastalih z zdruţenjem dveh ali več fragmentov DNA, ki v osnovi kodirajo različne proteine ali njihove domene. Kot rezultat uspešne translacije in pravilne konformacije posameznih fuzijskih partnerjev nastane nov protein z izkazanimi funkcionalnimi lastnostmi obeh izvornih proteinov [6]. Načrtovanje priprave fuzijskih proteinov zajema izbiro fuzijskih partnerjev, proučevanje lastnosti posameznega izvornega proteina ter način medsebojne povezave. Način povezave genskih konstruktov dveh proteinov je lahko neposreden, kar pomeni, da je en fuzijski partner preko C-konca direktno vezan na N-konec aminokislinskega zaporedja drugega; ali pa posreden, preko ustrezno dolgega povezovalca (ang. linker). Empirično ločimo tri razrede povezovalcev glede na njihovo strukturo: fleksibilne, rigidne in vmesnike s proteaznim cepitvenim mestom [6]. Pri načrtovanju genskega konstrukta moramo biti pazljivi na bralni okvir obeh fuzijskih partnerjev ter na dolţino povezovalca, ki je priporočljivo sestavljen iz 4-10 manjših polarnih aminokislinskih ostankov, kar omogoča nemoteno in pravilno zvijanje obeh proteinov. Poleg načina vezave je pomembna tudi smer vezave fuzijskega partnerja. Glede na poznano tridimenzionalno strukturo proteina in lokacijo aktivnega mesta lahko dodajamo fuzijske partnerje na N- ali C- konec, da preprečimo sterično oviranje vezavnega ali katalitičnega mesta ter omogočimo pravilno zvijanje proteina [7]. Zahvaljujoč tehnologiji rekombinantne DNA načrtno pripravljamo fuzijske proteine z nameni ustvarjanja proteinov s kombiniranimi funkcijami (terapevtskim proteinom npr. dodamo biološki učinek ali izboljšamo njihove farmakokinetične lastnosti), izboljšamo nivo izraţanja, olajšamo in izboljšamo čiščenje proteinov ter njihovo topnost [8], [9]. 3

15 1.2.1 Peptidne oznake Peptidne oznake (ang. tags) so kratka peptidna zaporedja, ki specifično prepoznajo in interagirajo z določenimi ligandi ter so namenjena podaljševanju koncev proteinov. Nameni uporabe peptidnih oznak so zlasti moţnost uporabe univerzalnih kromatografskih tehnik pri izolaciji z njimi označenih proteinov in povečani izkoristki pri čiščenju ter enostavnejša detekcija rekombinantnega proteina, vendar lahko povzročijo tudi spremembe v konformaciji proteina, zniţajo nivo izraţanja proteinov ter spremenijo biološko aktivnost. Glede na namen uporabe ločimo različne peptidne oznake, med katerimi so najpogosteje uporabljeni afinitetni podaljški proteinov, ki olajšajo ter izboljšajo učinkovitost čiščenja. Najpogosteje uporabljen afinitetni podaljšek je polihistidinski podaljšek (ang. His-tag), sestavljen iz 6-10 zaporedno povezanih histidinskih ostankov, ki praviloma ne vplivajo na aktivnost izraţenega proteina in omogočajo zelo učinkovito čiščenje proteina s kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo (ang. immobilized metal affinity chromatography, IMAC) [10] Strep-tag Strep-tag je afinitetni podaljšek z aminokislinskim zaporedjem AWRHPQFGG in s specifično reverzibilno vezavo na streptavidin, kar predstavlja učinkovito moţnost za afinitetno čiščenje ter pomemben sistem za detekcijo proteinov z uporabo konjugatov s (strept)avidinom. Rekombinantne fuzijske proteine, označene s Strep-tag-om, očistimo s streptavidinsko afinitetno kromatografijo v enem koraku. Na kolono z imobiliziranim streptavidinom nanesemo kompleksno mešanico proteinov (npr. celični lizat), pri čemer se rekombinantni protein s Strep-tag-om veţe na streptavidin, nato speremo nečistote s primernim pufrom, tarčni protein pa eluiramo kompetitivno z 1-5 mm raztopino biotina ali njegovih derivatov. Biotin predstavlja visokospecifičen, visokoafinitetni ter nizkomolekularni ligand streptavidina [11]. Prednosti Strep-tag-a pred ostalimi afinitetnimi podaljški so dostopnost do številnih komercialnih streptavidinskih konjugatov (uporabnih kot ligandov v afinitetni kromatografiji ali za detekcijo označenih rekombinantnih proteinov), visoka specifičnost elucije z biotinom, poleg tega oznaka Strep-tag praviloma ne moti biološke funkcije tarčnega fuzijskega proteina. Slabost Strep-tag-a je nizka afiniteta vezave na streptavidin (K d = 72 µm) [12], zaradi česar je razvoj privedel do novega podaljška, imenovanega SBP-tag. Slednji je imel višjo afiniteto vezave na streptavidin, z ravnoteţno konstanto disociacije K d = 2,5 nm, vendar z dodatnim problemom relativno dolgim zaporedjem iz 38 aminokislinskih ostankov [10]. 4

16 Nano-tag Nano-tag je afinitetni podaljšek, načrtovan za laţje čiščenje in detekcijo proteinov in predstavlja izboljšano različico Strep-tag-a. Ime je dobil po nanomolarni afiniteti za vezavo na streptavidin. Trenutno uporabljamo dve različici, Nano-tag(9) z 9 (DVEAWLGAR) ter Nanotag(15) (DVEAWLGARVPLVET) s 15 aminokislinskim ostanki. Namen načrtovanja je bil oblikovati nov afinitetni podaljšek z dolţino, primerljivo Strep-tag-u, ter visoko afiniteto do vezave na streptavidin [13]. Nano-tag je bil ustvarjen s pomočjo presajanja knjiţnic naključnih peptidov dolţine vsaj 15 aminokislin. Z in vitro selekcijskimi tehnikami so identificirali peptide s specifično vezavo na streptavidin. Peptid z najboljšo vezavno sposobnostjo so izolirali in strukturno analizirali interakcijo s streptavidinom ter izvedli optimizacijo v afinitetni podaljšek [13]. Sprva so načrtovali peptidno oznako Nano-tag za namen čiščenja rekombinantnih proteinov iz E. coli. Nano-tag(15) z zelo visoko afiniteto vezave (K d = 4 nm) so predlagali kot oznako za visoko občutljive detekcijske metode, krajšo različico Nano-tag(9) pa za čiščenje rekombinantnih proteinov [13]. 1.3 STREPTAVIDIN-BIOTIN Streptavidin in njegovi homologi so široko uporabljani v biokemijskih analiznih ter preparativnih tehnikah zaradi stabilne strukture (strept)avidina, specifičnosti in visoko afinitetne interakcije z biotinom. Streptavidin, izoliran iz bakterije Streptomyces avidinii, je 56 kda velik homotetramer, podoben avidinu, proteinu, izoliranemu iz jajčnega beljaka. Oba proteina sta si zelo podobna - njune skupne prednosti se odraţajo v termostabilnosti, odpornosti proti ekstremnim vrednostim ph, encimski razgradnji in denaturaciji, kar izkoriščamo pri njuni uporabi pri širokem razponu eksperimentalnih pogojev. Kljub temu ima streptavidin dodatne prednosti: ni glikoziliran, kar ne predstavlja tveganja za vezavo na glikoproteinske receptorje, razlike v aminokislinskem zaporedju (v primerjavi z avidinom) pa se odraţajo v niţji izoelektrični točki (pi~7) ter s tem v manjši verjetnosti nespecifičnih interakcij z negativno nabito površino celic ali negativno nabito molekulo DNA, kar vodi do pogostejše uporabe sistema streptavidin-biotin v razvoju eksperimentalnih metod [14]. Streptavidin vsebuje štiri enake podenote, vsako z vezavnim mestom za biotin z ravnoteţno konstanto disociacije K d ~ M, in predstavlja dobro osnovo za proteinsko inţenirstvo, saj 5

17 dopušča številne ter obširne mutacije, kar se odraţa v številnih različicah (monovalentni, monomerni streptavidin) [15]. Biotin, znan tudi kot vitamin H, je prisoten v vsaki ţivi celici in predstavlja kofaktor pri karboksilaciji proteinov [16]. Interakcijo med majhnim biotinom in streptavidinu podobnimi molekulami zaradi robustnosti in visoke prilagodljivosti izkoriščamo v številnih biokemijskih in biotehnoloških analiznih ter preparativnih metodah. Osnova različnih analiznih tehnik je kompleks streptavidin-biotin, kjer je streptavidin označen z reportersko komponento (z encimom, fluorescentnim barvilom, kemiluminiscentno ali radioaktivno sondo), in primarna detekcijska komponenta (običajno protitelo) označena z biotinom. Visoka specifičnost protiteles zagotavlja prepoznavo tarčne molekule in vezavo na specifične antigene. Z vezavo več molekul biotina na protitelo ustvarimo številna vezavna mesta za streptavidin, ki ga označimo (z encimom, fluoroforjem) in na tak način ustvarimo občutljivo detekcijo za določen antigen zaradi amplifikacije signala. Večina tako oblikovanih detekcijskih komponent uporablja konjugate streptavidina (SA-HRP) z encimi ali fluorofori (slika 1) [17]. Slika 1: Osnovni princip testov na osnovi interakcije (strept)avidin-biotin [17]. Pri razvoju novega načina detekcije, ki temelji na streptavidin-biotinski interakciji, je nujno potrebno natančno predhodno načrtovanje streptavidinskih konjugatov in/ali biotiniliranih komponent. Priprava streptavidinskega konjugata temelji na pripenjanju ustrezne molekule, ki omogoča neposredno specifično detekcijo (npr. fluorofor, radioaktivni kompleks), ali encima (npr. hrenove peroksidaze) za posredno detekcijo pretvorbe specifičnega substrata [14]. 6

18 V primeru izkoriščanja interakcije biotin-(strept)avidin moramo običajno na eno (proteinsko) komponento kovalentno vezati biotin. Poznamo več različnih pristopov kovalentnega označevanja z biotinom, tj. biotinilacije. Neposredna kemijska biotinilacija je najpogostejša, a je večinoma neselektivna. Encimska biotinilacija, ki poteka in vivo s pomočjo encimov, ki pripenjajo biotinsko skupino na specifični fuzijski partner rekombinantnega proteina, predstavlja visoko selektivno metodo [15]. 1.4 AFINITETNA KROMATOGRAFIJA Afinitetna kromatografija je oblika kromatografije, pri kateri ločevanje proteinov temelji na reverzibilnih interakcijah med proteinom (analitom) in ligandom, imobiliziranem na kromatografski nosilec. Stacionarno fazo afinitetne kromatografije običajno predstavlja agaroza ali dekstran, na katera pripnemo različne biološke ligande - protitelesa, receptorje, encime, antigene, kofaktorje ali substrate encimov. Imobilizacija bioloških ligandov lahko poteka neposredno na nosilec, bolj običajno pa ligand veţemo preko povezovalcev (krajše alkilne verige). Mobilno fazo predstavlja ustrezen pufer, v katerem sta stabilna tako analit kot ligand. Afinitetna kromatografija zajema štiri osnovne korake. Prvi korak je ekvilibracija kolone z ustreznim pufrom, v katerem je raztopljen analit. Sledi nanos vzorca, kjer se analit preko specifičnih interakcij (prevladujejo elektrostatske in van der Waalsove interakcije ter vodikove vezi) veţe na afinitetni adsorbent. Kolono nato spiramo z ustreznim pufrom, s čimer odstranimo nevezane komponente ali nespecifično adsorbirane nečistoče. Sledi elucija vezane biološke molekule, ki jo lahko izvedemo na specifičen način (s kompetitivnim ligandom) ali na nespecifičen način (s spremembo pogojev) [18]. Nespecifičen način elucije vključuje spremembo ph, ionske moči, temperature ali polarnosti pufra, v ekstremnih pogojih lahko dodamo tudi denaturant (ureo ali gvanidinijev klorid). Dobro poznavanje narave specifične interakcije med ligandom ter biološko molekulo nam omogoča optimalno uporabo sprememb pogojev. Afinitetna kromatografija je visoko selektivna metoda ločevanja s številnimi prednostmi, kot so visoka kapaciteta, dobra ločljivost in sposobnost koncentriranja vzorca, kar omogoča visoke izkoristke čiščenja bioloških molekul. Velikokrat pa se tudi pri afinitetni kromatografiji v praksi pojavijo teţave s prešibko vezanimi analiti in posledično izgubo proteina. Kljub hitremu razvoju metod še vedno primanjkuje visoko selektivnih stacionarnih 7

19 faz, a slabostim se lahko izognemo z uporabo specifične elucije (s kompetitivnim ligandom) ali z uporabo dodatnih tehnik čiščenja. 1.5 TEHNOLOGIJA FRET Prenos energije z resonanco fluorescence ali krajše FRET (ang. fluorescence resonace energy transfer) je fizikalen pojav, pri katerem sta udeleţena dva fluorofora na ustrezni razdalji. Pri ekscitaciji s svetlobo določene valovne dolţine pride do prenosa energije z donorskega na akceptorski fluorofor. Pri ustrezno majhni razdalji med obema fluoroforoma ne pride do emisije svetlobe donorskega fluorofora (nasprotno pri povečanju razdalje med donorjem in akceptorjem ekscitacija privede do emisije elektromagnetnega valovanja). Običajno se takšen resonančni prenos zgodi znotraj razdalje 1-10 nm brez pretvorbe v toplotno energijo ter brez neposrednega molekulskega stika. Razdalja, pri kateri je 50 % ekscitacijske energije donorja še deaktivirane, imenujemo Försterjev radij in znaša med 3 in 6 nm. Pojav FRET lahko zaznamo bodisi s spremljanjem fluorescence akceptorske molekule ali pa preko zmanjšanja fluorescence donorske molekule. V donorski molekuli pri ekscitaciji s svetlobo primerne valovne dolţine pride do premika elektrona iz osnovnega v višje, vzbujeno stanje. Znotraj kratkega časovnega intervala (območje pikosekund) elektron preide v najniţje vzbujeno stanje, medtem ko v nanosekundnem intervalu elektron preide nazaj v osnovno stanje, pri čemer pride do oddaje fotona, kar zaznamo kot fluorescenco. Pri pojavu FRET vzbujanje donorske sonde privede do prenosa energije na akceptorsko molekulo brez dejanskega oddajanja fotonov (ob predpostavki, da je akceptorska molekula znotraj Försterjevega radija), kar pa povzroči zadušitev fluorescence donorja (slika 2) [19]. 8

20 Slika 2: Prenos resonančne energije z donorske na akceptorsko molekulo [20]. Za detekcijo in kvantifikacijo pojava FRET poznamo več različnih pristopov, saj je rezultat lahko viden v povišanju fluorescence akceptorske molekule ali utišanju fluorescence donorske molekule, zaradi česar lahko določimo razmerje med tema izmerjenima signaloma. Prednost omenjenega pristopa je moţnost preučevanja interakcij med dvema primerno označenima ligandoma. Interakcije, kjer eden od ligandov, označen z donorsko fluorescenčno sondo, pride v neposredno bliţino vezavnega partnerja, označenega z akceptorsko fluorescenčno molekulo (dušilcem), vodijo v izgubo signala. Obratno pa pri prekinitvi interakcij, kjer se razdalja med fluorescenčnim donorjem in dušilcem poveča, pride do nastanka signala, tj. pojava fluorescence [21]. Za vzpostavitev celotnega eksperimenta na osnovi tehnologije FRET je potrebno predhodno proučiti veliko dejavnikov. Primarni pogoj je izbira primernega donor-akceptorskega para z elektronskimi prehodi v višje vzbujeno stanje pod vplivom UV-, vidnega ali IR-območja. Pogoj za delovanje je prekrivanje spektra med emisijo donorja ter ekscitacijskim vrhom akceptorja, paralelna orientacija dipola za učinkovit prenos energije med njima ter hkrati majhna razdalja med obema molekulama (med 1-10 nm). Kritična točka eksperimenta s tehnologijo FRET je izbira akceptorja s primerno valovno dolţino za prekrivanje fluorescence, pri čemer je potrebno pazljivo izbrati valovno dolţino, primerno za ekscitacijo donorske molekule z minimalnim vplivom na akceptorsko molekulo. Poleg vseh zahtev je potrebna tudi zadostna koncentracija tako donorske, kot tudi akceptorske molekule [22]. Primer optimalnega opisanega donor-akceptorskega para predstavljata fluorofor TAMRA in akceptorska molekula QSY-7 (slika 3). TAMRA ali 5 -karboksitetrametilrodamin, fluorescentno barvilo z absorpcijskim vrhom pri 555 nm, ki oddaja svetlobo valovne dolţine 9

21 580 nm (vijolične barve), primarno uporabljamo za označevanje oligonukleotidov, vendar je z njim mogoče označevati tudi druge biološke molekule. QSY-7 predstavlja nefluorescentno akceptorsko molekulo (zato t.i. dušilec fluorescence) s širokim ekscitacijskim območjem (valovne dolţine med 500 in 600 nm), zelo uporabno v tehnologiji FRET. Ob majhni razdalji med obema omenjenima molekulama pride do resonančnega prenosa fluorescenčne energije na dušilec QSY-7 in do izgube signala v obliki izsevane svetlobe donorja [23]. Slika 3: Struktura fluorescentnega barvila TAMRA in akceptorske molekule QSY-7 [24]. Tehnologija FRET je ena izmed uporabnejših tehnik za spremljanje konformacijskih sprememb v bioloških sistemih. Uporabljamo jo predvsem pri študiju interakcij posameznih bioloških molekul, pri določevanju strukture in konformacije proteinov in nukleinskih kislin in za spremljanje znotrajceličnih signalnih poti ter lokalizacije celičnih komponent v realnem času. Njena uporaba je prav tako pomembna pri rešetanju aktivnosti visoke zmogljivosti novo razvitih biološko aktivnih molekul [21]. Široka in raznolika uporaba je posledica številnih prednosti metode. Ena izmed pomembnejših je relativno enostavna avtomatizacija ter velika prilagodljivost, saj lahko izvajamo detekcijo s številnimi dostopnimi barvili. Princip detekcije pripomore k zmanjšanju vpliva avtofluorescence ter omogoča sklopljenje z drugimi tehnikami. Kljub temu pa ima tehnologija FRET tudi nekatere pomanjkljivosti; intenziteta signala je odvisna od več dejavnikov, kot sta orientacija barvil in velikost kompleksa, testne spojine pa lahko absorbirajo UV-svetlobo, kar posledično privede do nezadostne ekscitacije donorskih molekul. Uvedba ustreznih kontrol k testu ter sekundarnih testov odstrani nekatere slabosti [25]. 10

22 2. NAMEN NALOGE Uravnavanje bioloških procesov temelji na interakcijah med biološkimi (makro)molekulami. Ena izmed pomembnejših metod za detekcijo in vrednotenje interakcij je tehnologija prenosa energije z resonanco fluorescence (FRET). Zaradi vse hitrejšega napredka v bioloških in kemijskih znanosti ter vsakodnevnega odkrivanja novih peptidov in proteinov oziroma njihovih funkcij se povečuje tudi potreba po razvoju novih tehnologij za kvalitativno ter kvantitativno vrednotenje interakcij. S ciljem vzpostavitve modelnega testa za detekcijo ligandov streptavidina s pomočjo tehnologije FRET je naš namen načrtovati ter pripraviti modelni fuzijski protein, zgrajen iz nosilnega proteina (domena B stafilokoknega proteina A) in ustreznega peptidnega liganda streptavidina (t.i. Nano-tag(9)). Rekombinantna domena stafilokoknega proteina A je topen, majhen in stabilen protein, ki ga lahko v velikih količinah izrazimo v ekspresijskem sistemu Escherichia coli. S pomočjo tehnologije rekombinantne DNA bomo na N-konec domene B stafilokoknega proteina A uvedli ţe znano aminokislinsko zaporedje Nano-tag(9), ki se specifično in z visoko afiniteto veţe na streptavidin ter pri tem tekmuje z biotinom. Načrtovani fuzijski protein in streptavidin tako predstavljata dva modelna proteinska vezavna partnerja, biotin pa je učinkovit modelni nizkomolekularni inhibitor njune medsebojne interakcije. Genski konstrukt za fuzijski protein bomo vstavili v ekspresijski vektor pet-28 ter protein izrazili v bakterijskih celicah Escherichia coli. Po izolaciji in čiščenju fuzijskega proteina z uporabo kromatografskih tehnik bomo določili njegovo koncentracijo, preverili ustreznost aminokislinskega zaporedja s pomočjo Edmanove razgradnje in funkcionalnost fuzijskega proteina ovrednotili s prilagojenimi encimsko-imunskimi testi (ELISA). V primeru funkcionalnosti fuzijskega proteina bomo slednjega označili s fluorescenčnim barvilom TAMRA, streptavidin pa z dušilcem fluorescence QSY-7. Po dodatku izpodrivajočega liganda (biotin) bomo razpad kompleksa detektirali s pomočjo zaznave porasta fluorescence pri 580 nm (slika 4). 11

23 Slika 4: Predstavitev načrtovanega sistema FRET. 12

24 3. MATERIALI IN METODE 3.1. MATERIALI Kemikalije Kemikalija aceton acetonitril agar agaroza akrilamid/ bisakrilamid 40 % APS (amonijev persulfat) biotin bromfenol modro CaCl 2 Coomassie modro DMF (dimetilformamid) DMSO (dimetilsulfoksid) dioksan DTT (ditiotreitol) EDTA (etilendiamin tetraocetna kislina) etanol, 96 % glicerol HCl (37 %) H 2 O 2 (30 %) H 2 SO 4 (konc.) imidazol IPTG (izopropil-β-d-1-tiogalaktopiranozid) izopropanol kanamicin KCl K 2 CO 3 K 2 HPO 4 kloramfenikol kvasni ekstrakt Bacto TM Yeast Extract MgCl 2 Proizvajalec Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Merck, Darmstadt, Nemčija Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Promega, Madison, WI, ZDA Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Fluka, Buchs, Švica Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Fluka, Buchs, Švica Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Kemika, Zagreb, Hrvaška Fluka, Buchs, Švica Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Riedel-de Haën AG, Nemčija Fluka Chemie, Buchs, Švica Fluka, Buchs, Švica Merck, Darmstadt, Nemčija Merck, Darmstadt, Nemčija Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Promega, Madison, WI, ZDA Carlo Erba, Rodano, Italija Sigma, St. Louis, MO, ZDA Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Merck, Darmstadt, Nemčija Merck, Darmstadt, Nemčija Sigma, St. Louis, MO, ZDA Becton Dickinson and Co., Sparks, MD, ZDA Merck, Darmstadt, Nemčija 13

25 NaDS (natrijev dodecil sulfat) Na 2 HPO 4 Na 2 HPO 4 2H 2 O NaCl nanašalno barvilo za gelsko elektroforezo DNA Loading Dye (6x) NaOH posneto mleko v prahu SYBR Safe Tris (tris(hidroksimetil)aminometan) TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidin) TEMED (N, N, N', N'-tetrametiletilendiamin) Tween 20 THF (tetrahidrofuran) TFEF (2,2,2-trifluoroetilformat) urea X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktozid) Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Merck, Darmstadt, Nemčija Thermo Scientific, Rockford, ZDA Fluka, Buchs, Švica Pomurske mlekarne, Murska Sobota, Slovenija Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA Sigma Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Nemčija Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Abbott Laboratories, Global Pharmaceutical R&D, Illinois, ZDA Merck, Darmstadt, Nemčija Sigma, St. Louis, MO, ZDA Biološki material Encimi za molekularno kloniranje Encim HindIII NcoI SacII XhoI T4 DNA-ligaza DNaza Prepoznavno in cepitveno mesto A A G C T T T T C G A A C C A T G G G G T A C C C C G C G G G G C G C C C T C G A G G A G C T C Proizvajalec New England Biolabs, Ipswich, MA, ZDA New England Biolabs, Ipswich, MA, ZDA New England Biolabs, Ipswich, MA, ZDA New England Biolabs, Ipswich, MA, ZDA New England Biolabs, Ipswich, MA, ZDA Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA 14

26 Začetni oligonukleotidi Oznaka Nukleotidno zaporedje (5-3 ) F_cod_Nano9_Bins 5 -fosfo-catggatgttgaagcttggctgggtgcgcgttccgc-3 R_nc_Nano9_Bins R-XhoI_Bd začetni oligonukleotid T7 5 -fosfo-ggaacgcgcacccagccaagcttcaacatc-3 5 -TCACCTCGAGTTTTGGTGCTTGTGCATC-3 5 -TAATACGACTCACTATAGGG-3 Gostiteljski bakterijski sevi Proizvajalec E. coli Top10 Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA E. coli BL21(DE3) plyss Novagen (Merck KgaA), Darmstadt, Nemčija Kompleti Komplet Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit GenElute Plasmid Miniprep Kit QIAEX II Agarose Gel Extraction Super Signal West Dura Extended Duration Substrate Proizvajalec Pierce, Rockford, IL, ZDA Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA Qiagen, Hilden, Nemčija Thermo Scientific, Rockford, ZDA Označevalci velikosti Označevalec velikosti označevalec velikosti za proteinsko elektroforezo SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard označevalec velikosti Gene Ruler 50 bp DNA Ladder označevalec velikosti Gene Ruler 1 kbp DNA Ladder Proizvajalec Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA Fermentas, Burlington, Kanada Fermentas, Burlington, Kanada Plazmidni vektor pet-28/b_insert Izvorni vektor je predstavljal modificiran plazmid pet-28/b_insert z nukleotidnim zaporedjem predstavljenim v prilogi 2. Pripravljen je bil na Katedri za farmacevtsko biologijo, FFA, UL [26] in se od izvornega komercialnega vektorja pet-28 razlikuje v tem, da vsebuje dodatno restrikcijsko mesto SacII neposredno pred kodirajočim delom domene B stafilokoknega proteina A, sicer vstavljenim med restrikcijski mesti NcoI in XhoI. Peptidi in proteini B-BSA (biotiniliran goveji serumski albumin), shranjen pri -20 C Proizvajalec Biotinilacijo BSA je izvedel doc.dr. Bratkovič s pomočjo kompleta EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (Pierce, Rockford, IL, ZDA) po navodilih 15

27 B-LEP (biotiniliran človeški leptin); 0,82 mg/ml, shranjen pri -20 C BSA (goveji serumski albumin); liofilizat, shranjen pri 4 C fragment Fc humanega IgG Raztopino proteina v pufru PBS smo shranjevali pri 4 C kozje protitelo proti humani regiji Fc IgG, konjugirano s hrenovo peroksidazo (anti Fc higg-hrp), shranjeno pri 4 C mab proti bakteriofagu M13, konjugirano s hrenovo peroksidazo (anti-m13-mab-hrp), shranjeno pri -20 C zajčje poliklonsko protitelo proti histidinskemu podaljšku (Rb pab anti HisTag), shranjeno pri 4 C streptavidin, konjugiran s hrenovo peroksidazo (SA -HRP), shranjen pri -20 C streptavidin; liofilizat, shranjen pri -20 C proizvajalca. Biotinilacijo leptina je izvedel asist. P. Molek s pomočjo kompleta EZ-Link NHS-PEG4-Biotin (Pierce, Rockford, IL, ZDA) po navodilih proizvajalca. Proizvajalec leptina: R&D Systems, ZDA Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA Jackson ImmunoResearch Europe, Ltd, Suffolk, Velika Britanija Merck Millipore, (Merck KgaA), Darmstadt, Nemčija GE Healthcare, Little Chalfont, Zdruţeno kraljestvo GenScript corp., Piscataway, NJ, ZDA GenScript corp., Piscataway, NJ, ZDA New England Biolabs, ZDA Pufri, raztopine, gojišča, geli Pufri Blokirni pufer Pufer za redčenje Elektroforezni pufer (Tris-glicin) 10x, ph~8,3 (240 mm Tris / 1'9 M glicin / 35 mm SDS) Elucijski pufer 1 Elucijski pufer 2 Fosfatni pufer s soljo (PBS), ph 7,4 Sestava in postopek priprave 5 % raztopina mleka v prahu: Mleko v prahu 500 mg PBS ad 10 ml 2 % BSA v 0,1 % PBST: BSA 140 mg PBST ad 7 ml 0,5 % BSA v 0,1 % PBST: BSA 10 mg PBST ad 2,0 ml Tris 15,14 g NaDS 5,0 g Glicin 93,88 g ph uravnamo s pomočjo 1 M HCl oz. NaOH ddh 2 0 ad 500 ml 10 mm biotin: Biotin 3,5 mg PBS 1,00 ml 250 mm imidazol v PBS: Imidazol 511 mg PBS ad 30,0 ml NaCl 3,2 g KCl 0,08 g Na 2 HPO 4 0,576 g K 2 HPO 4 0,096 g ddh 2 0 ad 400 ml 50 mm Tris/500 mm NaCl/pH 7,4 Tris 1,21 g 16

28 IMAC pufer A NaCl 5,84 g ddh 2 0 ad 200,0 ml Pred uporabo filtriramo. IMAC pufer B Karbonatni pufer NaDS nanašalni pufer (125 mm Tris HCl ph 6,8 / 20% glicerol / 4% SDS / 0,005% bromfenol modro) Pufer za spiranje (PBST) Pufer za prenos western TAE-pufer TBS (Tris-pufer s soljo), ph 7 5 Imidazol 2,56 g IMAC pufer A 150 ml Pred uporabo filtriramo. 0,1M Na-karbonat, ph 10,0: NaHCO mg ddh 2 0 ad 30,0mL 10 mm Na-karbonat, ph 10,0: NaHCO 3 25,3 mg ddh 2 0 ad 30,0 ml Tris 0,242g NaDS 0,80 g bromfenolmodro 0,04 g glicerol 4,0 ml ddh 2 0 ad 40,0 ml 0,01 %;0,1 %; 0,2 %; 0,5 % Tween 20 v PBS Tris 5,86 g glicin 11,62 g 10 % SDS 7,5 ml MeOH 400 ml ddh 2 0 ad 2 L Tris 4,84 g ocetna kislina 1,14 ml 0,5 M EDTA 3,7 g ddh 2 0 ad 100 ml Tris 3,03 g NaCl 4,38 g ddh 2 0 ad 500 ml Raztopina 1 M raztopina IPTG 2 % raztopina X-gal Raztopina kromogenega substrata TMB Raztopini za barvanje s Coomassie Brilliant Blue Sestava in postopek priprave IPTG 2,38 g ddh 2 0 ad 10,0 ml Navedeno količino IPTG ustrezno natehtamo, raztopimo v vodi, steriliziramo s filtracijo, razdelimo v mikrocentrifugirke ter shranimo pri 20 C. X-gal 0,2 g DMF 10,0 ml Navedeno količino natehtamo ter raztopimo v DMF.Razdelimo v mikrocentrifugirke ter zaščitimo pred svetlobo shranimo pri -20 C. TMB (0,1 mg/ml) 1,5 ml H ,3 µl Vsakič pripravimo sveţe tik pred uporabo. Raztopina za barvanje (0,1 % Coomassie modro/1 % AcOH/40 % MeOH v ddh 2 0) : ocetna kislina 500 ml Coomassie modro 0,05 g metanol 20 ml ddh 2 0 ad 50 ml Raztopina za razbarvanje (30 % EtOH/10 % 17

29 AcOH v ddh 2 0): ocetna kislina 20 ml 95 % etanol 60 ml ddh 2 0 ad 200 ml Gojišča Sestava pepton 4,0 g Tekoče gojišče LB kvasni ekstrakt 2,0 g NaCl 2,0 g ddh 2 0 ad 400 ml Trdno gojišče LB-agar tekoče gojišče LB 200 ml agar 1,4 g tripton 3,2 g Tekoče gojišče 2xTY kvasni ekstrakt 2,0 g NaCl 1,0 g ddh 2 0 ad 200 ml Za pripravo tekočih gojišč smo navedene količine komponent natehtali, dodali vodo in dobro premešali. Gojišča smo avtoklavirali ter po potrebi dodali ustrezne antibiotike v ohlajena gojišča tik pred uporabo. Pri trdnih gojiščih smo ustrezno količino agarja dispergirali v ustreznem tekočem gojišču in mešanico avtoklavirali ter po potrebi dodali ustrezne antibiotike, ko je temperatura gojišča padla pod 50 C. Zatem smo zmes aseptično vlili v sterilne petrijevke in plošče po strditvi shranili pri 4 C. Sterilizacija pufrov, raztopin in gojišč z vodno paro je potekala 20 minut pri temperaturi 121 C in nadtlaku 1 bar. Pri sterilizaciji s filtracijo smo uporabili sterilne membranske filtre z velikostjo por 0,20 µm. Vrsta gela Sestava in postopek priprave 1 % agarozni gel: agaroze 0,75 g TAE pufer 75 ml Gel za agarozno elektroforezo SYBR Safe 7,5 µl 2,2 % agarozni gel: agaroze 1,65 g TAE pufer 75 ml SYBR Safe 7,5 μl V mikrovalovni pečici smo ustrezno količino agaroze raztalili v pufru TAE ter po ohladitvi na cca. 60 C dodali SYBR Safe. Gel smo vlili v kadičko. Gel za SDS-PAGE: 15 % ločevalni gel: 40 % akrilamid 1,313 ml 1,5 M Tris HCl, ph 8,8 0,875 ml ddh 2 0 1,243 ml 10 % NaDS 35 μl 10 % APS 35 μl TEMED 1,4 μl 18

30 5 % zbiralni gel 40 % akrilamid 250 μl 1,5M Tris-HCl, ph 6,8 250 μl ddh 2 0 1,46 ml 10 % NaDS 20 μl 10 % APS 20 μl TEMED 2,0 μl ddh 2 O, Tris pufer, akrilamid ter NaDS smo odpipetirali po tem vrstnem redu, premešali, dodali APS in TEMED, dobro premešali ter vlili med stekelci elektroforezne celice. Nosilec His-Select Nickel Affinity Gel (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ZDA) Pred uporabo smo medij enakomerno suspendirali Laboratorijska oprema in ostali material Oprema ali material Tip opreme/materiala in proizvajalec FPLC kromatografski sistem AKTAexplorer 10 GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Švedska analitska tehtnica AB 104 Mettler Toledo, Küsnacht, Švica ciklični termostat (za izvedbo PCR) GeneAmpR PCR System 2700 Applied Biosystems, Forster City, CA, ZDA avtoklav Systec 2540 EL Systec, Wettenberg, Nemčija celica za vertikalno elektorforezo Mini Protean 3 Cell Bio-Rad, Richmond, CA, ZDA celica za prenos western Transblot cell Bio-Rad, Richmond, CA, ZDA centrifugalna enota Amicon Ultra-4 Centrifugal Merck Millipore, (Merck KgaA), Darmstadt, Filter Unit centrifuge čitalec mikrotitrskih ploščic inkubator magnetni mešali Nemčija R in 5415 R Eppendorf, Hamburg, Nemčija -RC 5C Plus superspeed centrifuge Sorvall, New Castle, DE, ZDA Tecan GENios Tecan Group Ltd., Mannerdorf, Švica Unihood RCS-650 UniEquip, Martinsried, Nemčija Rotamix 550 MMH in Rotamix 606 MM obe Tehtnica, Ţelezniki, Slovenija mikrotitrske ploščice TPP Test Plate 96U TPP, Trasadingen, Švica mikrovalovna pečica LG, Seul, Juţna Koreja nitrocelulozna membrana Hybond ECL z velikostjo por 0,45 μm GE Healthcare, Piscataway, NJ, ZDA ph meter 691 ph meter Metrohm, Herisan, Švica pipete (0,5-10;10-100; ; ) µl precizna tehtnica sistem za opazovanje in fotografiranjom gelov ter membran G-box spektrofotometra 19 Eppendorf, Hamburg, Nemčija Exacta 610 EB Tehtnica, Ţelezniki, Slovenija Syngene, Frederick, MD, ZDA -Nanodrop ND-1000 NanoDrop Technologies, Delaware, ZDA

31 -Lambda 20 UV-VIS PerkinElmer, Wellesley, MA, ZDA stresalniki -Vibromix 403 EVT in Vibromix 204 EV oba Tehtnica, Ţelezniki, Slovenija -IKA MS3 digital IKA Works, Wilmington, ZDA -Eppendorf Thermomixer Comfort, 1 5 ml Eppendorf, Hamburg, Nemčija termoblok Thermomixer Comfort Eppendorf, Hamburg, Nemčija transiluminator TFX 20M Vilber Lourmat, Marne-La-Valee, Francija ultrazvočna sonda Ultrasonic Processor 130 Watt Cole Parmer, Vernon Hills, IL, ZDA vir napetosti za eletroforezne kadičke zamrzovalnik Sanyo Electric Biomedical Co., Tokio, Japonska zaščitena mikrobiološka komora LFVP 12 Iskra pio, Šentjernej, Slovenija 3.2. METODE Načrtovanje kloniranja Nano-tag(9) v vektorski sistem pet-28/b_insert Kot osnovni prejemni vektor smo uporabili plazmid pet-28/b_insert, ki vsebuje domeno B SpA v plazmidu pet-28 (genska karta plazmida pet-28 je v prilogi 1) z dodatnim uvedenim restrikcijskim mestom SacII na 5 -koncu kodirajoče regije gena domene B (nukleotidno zaporedje je v prilogi 2). Afinitetni podaljšek Nano-tag(9) smo se odločili izraziti kot fuzijski peptid na N-koncu domene B SpA. Za pripravo genskega zapisa za Nano-tag(9) smo uporabili dva para komplementarnih sinteznih oligonukleotidov, ki sta po hibridizaciji tvorila lepljiva konca ustreznih restrikcijskih mest (NcoI in SacII), kot je prikazano spodaj. V vektor pet- 28/B_insert smo vnesli fragment, ki kodira fuzijski peptid Nano-tag(9), prek restrikcijskih mest NcoI in SacII. Genski fragment (insert) po hibridizaciji oligonukleotidov za ligacijo v vektor pet- 28/B_insert: NcoI M D V E A W L G A R S SacII 5'-catggatgtggaagcgtggctgggcgcgcgctccgc-3' 3'-ctacaccttcgcaccgacccgcgcgcgagg-5' Podčrtani zaporedji predstavljata lepljive konce restrikcijskih mest; na 5 -koncu ostanek NcoI in na 3 -koncu ostanek SacII. 20

32 Molekulsko kloniranje Izolacija plazmidne DNA Priprava gojišč ter prekonočne bakterijske kulture V 100 ml erlenmajerico z utori smo dodali 10 ml tekočega gojišča LB z antibiotikom kanamicin (30 µg/ml) ter iz trajne kulture precepili bakterijsko kulturo E. coli DH5α s plazmidom pet-28/b_insert. Prekonočno kulturo smo preko noči inkubirali pri 37 C z močnim stresanjem Izolacija plazmidov iz bakterijskih kultur Izolacija plazmidne DNA iz bakterijske kulture je bila izvedena s pomočjo kompleta GenElute Plasmid Miniprep Kit po navodilih proizvajalca [27]. Izolacija temelji na uporabi kolon s silikagelno membrano, pri čemer izkoriščamo adsorpcijo molekule DNA na silikagel pri visoki ionski jakosti v šibko kislem okolju. Pri tem smo genomsko DNA odstranili ţe pred nanosom na kolono, saj se obori pri alkalni lizi celic in se enostavno posede med centrifugiranjem Hibridizacija oligonukleotidov Liofilizirana začetna oligonukleotida z vsebujočim zapisom za Nano-tag(9) smo raztopili v ddh 2 0 do končne koncentracije 100 µm. Tabela I: Volumni komponent v hibridizacijski mešanici Hibridizacijska mešanica: Volumen [µl] F_cod_Nano(9)_Bins 1,78 (~2µg ~178 pmol) R_comp_Nano(9)_Bins 1,78 (~1,637µg ~178 pmol) 10 T4 ligacijski pufer 5 ddh 2 O 41,44 V = 50 Hibridizacijsko mešanico smo segreli na 95 C za 3 minute, s tem povzročili denaturacijo, ohladili mešanico na sobno temperaturo v razmiku 1 ure, s čimer smo izzvali počasno prilagajanje oligonukleotidov ter vse do uporabe shranili na ledu Restrikcija izvornega vektorja pet-28/b_insert z restrikcijskima endonukleazama NcoI in SacII Restrikcija je rezanje molekule DNA z restrikcijskimi endonukleazami; tj. encimi, ki prepoznajo in cepijo točno določeno nukleotidno zaporedje (običajno dolţine med 4 in 8 bp) 21

33 na tope ali lepljive konce. Pri rezanju izoliranega plazmida pet-28/b_insert smo uporabili naslednjo reakcijsko mešanico: Tabela II: Sestava reakcijske mešanice za dvojno rezanje vektorja komponenta Volumen [µl] pet-28a/b_insert 10,5 (~1 µg) 10 NEBuffer 4 4 ddh NcoI 1,5 (~ 6x prebitek) SacII 1 (~20x prebitek) V =40 Reakcijsko zmes smo inkubirali 1,5 ure pri 37 C, posamezne fragmente smo ločili na agarozni gelski elektroforezi ter DNA ustrezne velikosti izolirali iz gela ( ) Agarozna gelska elektroforeza (AGE) ter detekcija DNA z barvilom SYBR Safe Agarozna gelska elektroforeza je metoda ločevanja fragmentov DNA po velikosti, saj je razmerje med nabojem in dolţino pri vseh molekulah DNA enako. V električnem polju molekule DNA zaradi negativnega naboja potujejo proti anodi, pri čemer zamreţenost gela bolj ali manj ovira potovanje različno dolgih molekul DNA; manjše molekule potujejo hitreje, večje pa počasneje. Zaznavanje fragmentov na gelu omogoča uporaba fluorescirajočega barvila SYBR Safe, ki se interkalira med bazne pare in kot tak pri obsevanju z ultravijolično svetlobo oddaja vidno svetlobo [28]. V posamezne žepke gela v elektroforezni kadički nanesemo vzorce DNA z dodanim nanašalnim pufrom (1/6 volumna vzorca). Elektroforeza je potekala v pufru TAE približno eno uro pri konstantni napetosti 90 V. Gel smo nato osvetlili z UV svetlobo ter fotografirali. Agarozno elektroforezo smo uporabili kot del izolacije rezanega plazmida (uporabimo 1 % agarozni gel) ter za analizo uspešnosti vstavitve insertov po PCR na osnovi kolonije (uporabimo 2,2 % agarozni gel) Ekstrakcija DNA iz agaroznega gela z uporabo kompleta QIAEX II Ekstrakcija DNA iz izrezanega koščka agaroznega gela po elektroforezni ločitvi nam omogoča izolacijo fragmentov točno določenih velikosti, s čimer se znebimo nečistot ter ostankov DNA po restrikciji ali PCR. Izolacijo in čiščenje DNA fragmenta smo izvedli s pomočjo kompleta QIAEX II po navodilih proizvajalca [29], le-ta temelji na raztapljanju agaroze ter selektivni adsorpciji molekule DNA na delce silikagela v prisotnosti soli v ustreznem pufru, priloţenem kompletu. 22

34 Izolacijo DNA iz koščka gela smo izvedli po rezanju plazmidne DNA z restrikcijskima endonukleazama in sledečim ločevanjem restrikcijske zmesi z agarozno gelsko elektroforezo [29] Ligacija inserta Nano-tag(9) (NcoI/SacII) v plazmid pet-28/b_insert Pri reakciji ligacije kovalentno poveţemo 3'- in 5'- konca verig DNA s pomočjo encima DNA-ligaze. V reakciji ligacije smo v vektor pet-28/b_insert, rezan z ustreznima restriktazama (NcoI in SacII), vstavili insert z zapisom za Nano-tag(9), ki smo ga pripravili s kombinacijo ustrezno načrtovanih sinteznih oligonukleotidov. Tabela III: Volumni komponent v ligacijski zmesi Ligacijske komponente rez. vekt. pet-28/b_ins NcoI/SacII insert Nano-tag(9) 10 T4 ligacijski pufer (NEB) T4 DNA ligaza (NEB) ddh 2 0 V =20 Volumen [µl] 8,85 (100 ng) 0,5 (13,2 ng ~ 20 mnoţinski prebitek) 2 1 7,65 Ligacijsko zmes smo inkubirali pri sobni temperaturi minut Delo z bakterijami Vnos plazmidov po ligaciji v kompetentne celice E. coli Top 10 Pojem transformacija zajema proces privzema genskega konstrukta v gostiteljsko celico. Celice, ki jih skušamo transformirati, morajo biti kompetentne, tj. ustrezno pripravljene, da sprejmejo tujo DNA. Pri našem eksperimentu smo izvedli transformacijo s toplotnim šokom. Kompetentnim celicam E. coli Top10, odtaljenim na ledu, smo dodali 9 µl ligacijske zmesi, nežno premešali ter inkubirali 20 min na ledu. Mikrocentrifugirko smo nato za 45 s potopili v vodno kopel, segreto na 42 C, in ponovno 3 min inkubirali na ledu. Zmesi smo zatem dodali 800 µl gojišča 2 TY in inkubirali med stresanjem (250 vrt./min) eno uro pri temperaturi 37 C. 100 μl bakterijske kulture smo aseptično prenesli na trdno gojišče LB-agar/kanamicin (35 µg/ml), preostanek smo centrifugirali, odstranili supernatant in ponovno suspendirali v majhni količini gojišča ter celotno koncentrirano suspenzijo bakterij prav tako aseptično razmazali po plošči z gojiščem LB-agar/kanamicin (35 µg/ml). Sledila je inkubacija plošč preko noči pri 37 C. 23

35 Vnos izoliranih plazmidov v kompetentne celice E. coli BL21(DE3) plyss Vnos izoliranega plazmida z genskim konstruktom za protein Nano-tag(9)-rBd v kompetentne celice E. coli BL21(DE3) plyss smo izvedli s toplotnim šokom. Kompetentnim celicam E. coli BL21(DE3) plyss, odtaljenim na ledu, smo dodali 0,7 µl izoliranega plazmida iz kolonije številka 4 z genskim konstruktom za protein Nano-tag(9)- rbd, nežno premešali in inkubirali 20 min na ledu. Mikrocentrifugirko smo nato inkubirali v vodni kopeli (42 C) natančno 45 s ter ponovno inkubirali na ledu. Zmesi smo dodali 900 µl gojišča 2 TY in inkubirali med stresanjem (250 vrt./min) eno uro pri temperaturi 37 C. 70 μl bakterijske kulture smo aseptično prenesli direktno na trdno gojišče LB-agar/kanamicin (35 µg/ml), preostanek smo centrifugirali, odstranili supernatant in ponovno suspendirali v majhni količini gojišča ter celotno koncentrirano suspenzijo bakterij prav tako aseptično razmazali po plošči z gojiščem LB-agar/kanamicin (35 µg/ml). Sledila je inkubacija plošč preko noči pri 37 C Izbor kolonij bakterijskih celic, ki vsebujejo rekombinanten plazmid, s pomočjo PCR (ang. colony PCR) PCR na osnovi kolonije (ang. colony PCR) je ena izmed mnogih izpeljank metode, ki omogoča hitro identifikacijo bakterijskih kolonij, ki so s transformacijo sprejele rekombinantni plazmid. Pri tem je ključnega pomena izbor in uporaba primernih začetnih oligonukleotidov, ki omogočajo razlikovanje med rekombinantnimi in izhodnimi vektorji na osnovi dolţin produktov reakcije PCR. Kot vir matrične DNA uporabimo kar kolonije iz agarnih gojišč, začetni oligonukleotidi pa so specifični za nukleotidno zaporedje v ali ob spremenjenem območju. Vzorci: 1. PK1 (0,1 µl izvornega plazmida pet-28/b_insert) 2. PK2 (0,1 µl ligacijske zmesi pri sobni temperaturi) 3. PK3 (0,1 µl ligacijske zmesi pri sobni temperaturi) 4. NK (dotik agarja) kolonij (dotik kolonij, zraslih na gojišču LB-agar/kanamicin (35 µg/ml)) 24

36 Tabela IV: Sestava PCR reakcijske zmesi (navedene količine so za en vzorec) za PCR na osnovi kolonije. Reagent 2 PCR mešanica T7 promotor (5 µm) R-XhoI_Bd (5 µm) ddh 2 0 matrična DNA 1 Volumen [µl] 5,0 0,5 0,5 4 V = Izolacija plazmidne DNA iz bakterijskih celic ("minipreparacija") Izolacijo plazmidov iz uspešno transformiranih bakterijskih kolonij smo izvedli s pomočjo kompleta GenElute Plasmid Miniprep Kit, pri čemer smo v celoti sledili navodilom proizvajalca [27] Spektrofotometrično ugotavljanje koncentracije plazmidne DNA Organske baze v nukleinskih kislinah (DNA in RNA) imajo širok absorpcijski vrh z maksimumom pri valovni dolţini 260 nm, kjer absorbirajo tudi druge snovi (proteini in fenoli), zaradi česar je zelo pomembno, da je vzorec čist. Čistočo vzorca DNA v smislu odsotnosti RNA in proteinov lahko določimo s pomočjo razmerja absorbanc A 260 /A 280, pri čemer velja, da ima vodna raztopina čiste dvoveriţne DNA molekule razmerje okoli 1,8. Koncentracijo plazmidne DNA smo določili s spektrofotometrom NanoDrop 1000, ki je namenjen merjenju absorbanc zelo majhnih volumnov (1-2 µl). Pri izračunu koncentracije plazmidne DNA je pomembna vrednost absorbance pri 260 nm (A 260 ) ter poznavanje molarnega ekstincijskega koeficienta (ε) Določanje nukleotidnega zaporedja Določanje nukleotidnega zaporedja imenujemo DNA-sekvenciranje. Danes najpogosteje uporabljena metoda je Sangerjeva metoda sekvenciranja, kjer gre za modifikacijo veriţne reakcije s polimerazo. Molekuli DNA, ki ji ţelimo določiti nukleotidno zaporedje, dodamo zmes štirih deoksinukleotidov (datp, dgtp, dctp in dttp) in zmes štirih z različnimi fluorescenčnimi barvili označenih dideoksinukleotidov (ddatp, ddgtp, ddctp in ddttp) ter začetni oligonukleotid, komplementaren znanemu zaporedju neposredno ob preiskovanem. Dideoksinukleotidi (ddntp) imajo na 3 na ogljik pripet le vodikov atom (in ne OH-skupine), zaradi česar se ob njihovi vgraditvi podaljševanje DNA verige ustavi. Produkte PCR ločimo 1 matrična DNA = dotik kolonije oz. 0,1 µl lig. zmesi 25

37 glede na dolţino z gelsko (kapilarno) elektroforezo in po njihovem potovanju preko osvetljenega območja z laserskim ţarkom razberemo zaporedje nukleotidov na podlagi različnega fluoresciranja dideoksinukleotidov [30]. Vzorce izolirane plazmidne molekule DNA so analizirali v podjetju GATC Biotech AG (Konstanz, Nemčija), kjer so določili nukleotidno zaporedje molekul DNA Izražanje proteina Testno izraţanje proteina 450 μl prekonočne bakterijske kulture E. coli BL21(DE3)pLysS, transformirane z ustvarjenim rekombinantnim plazmidom pet-28/b_insert/nano-tag(9), smo prenesli v 55 ml gojišča 2xTY z dodanima kanamicinom (končna konc. 100 μg/ml) in kloramfenikolom (končna konc. 34 μg/ml) in ob stalnem stresanju (250 vrt./min) gojili pri temperaturi 37 C, dokler nismo dosegli optične gostote OD 600 ~ 0,5. Kulturo smo razdelili na 4 alikvote po 10 ml, dvema alikvotoma dodali 10 µl IPTG (dve inducirani ( IND) paraleli), v druga dva alikvota pa ničesar (dve neinducirani ( NEIND.) paraleli). Po eno IND in NEIND paralelo smo inkubirali pri dveh različnih temperaturah (30 C in 37 C) 3-4h ob močnem stresanju pri 250 vrt./min. Pri 600 nm smo pomerili končne absorbance bakterijskih brozg ter jih 10 minut centrifugirali s 6000g pri 4 C. Usedlino smo suspendirali v 2 ml PBS ter centrifugirali pod enakimi pogoji, usedlino smo zopet suspendirali v ustreznem volumnu PBS do enake končne gostote celic. Sledilo je zamrzovanje, odtaljevanje in razbitje celic s pomočjo ultrazvočne sonde. Celoti smo dodali DNazo (do končne koncentracije 10 µg/ml), potrebne soli za delovanje encima (MgCl 2 in CaCl 2 ) in stresali 10 min pri sobni temperaturi. Sledilo je centrifugiranje 10 min pri maksimalni hitrosti pri 4 C; supernatant je predstavljal topno proteinsko frakcijo, usedlino smo suspendiramo v PBS in s tem dobili netopno proteinsko frakcijo. Vse dobljene frakcije smo analizirali s pomočjo NaDS-PAGE Izraţanje proteina v bakterijski kulturi večjega volumna 5 ml prekonočne bakterijske kulture smo precepili v 900 ml tekočega gojišča TB z dodanima antibiotikoma kanamicinom (100 µg/ml) in kloramfenikolom (34 µg/ml) ter inkubirali pri stalnem stresanju 250 vrt./min pri 37 C do optične gostote OD 600 ~ 0,4. Zatem smo inducirali izražanje rekombinantnega proteina z dodatkom IPTG (do končne konc. 1 mm) ter nadaljevali z inkubacijo pri enakih pogojih še 4 ure (do končne optične gostote OD 600 ~ 6). 26

38 Brozgo smo 20 minut centrifugirali pri 6000g in 4 C. Celično usedlino smo sprali s 40 ml PBS ter usedlino ponovno suspendirali v 40 ml PBS. Bakterijsko suspenzijo smo zamrznili ter odtalili na ledu, dodali DNazo in sonicirali s pomočjo ultrazvočne sonde, da smo razbili celice. Sledilo je 10 minutno centrifugiranje pri maksimalni hitrosti in 4 C in shranili supernatant, ki je predstavljal topno frakcijo bakterijskega lizata Izolacija, čiščenje in analiza proteina Kovinsko-kelatna afinitetna kromatografija (IMAC) Izolacija proteinov je velikokrat teţaven proces zaradi njihove kompleksne strukture in različnih fizikalno-kemijskih lastnosti. Številne lastnosti proteinov v kompleksih vzorcih so si med seboj zelo podobne, kar onemogoča učinkovito čiščenje oz. izolacijo ţelenega proteina v enem samem koraku. Razvoj afinitetnih kromatografij pa je omogočil zelo visoko čistost posamezne komponente v vzorcu zgolj v enem koraku. Pri tem v afinitetnih kromatografijah izkoriščamo intrinzične lastnosti določenih proteinov (npr. uporaba nosilcev s protitelesi proti ţelenemu proteinu) ali pa na protein uvedemo tako imenovane afinitetne podaljške, ki omogočajo vezavo na točno določen afinitetni nosilec. IMAC (ang. Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography) temelji na reverzibilni tvorbi koordinacijskih vezi med imobiliziranimi ioni nekaterih prehodnih kovin (Ni 2+, Co 2+ ) na stacionarni fazi ter nekaterimi stranskimi verigami aminokislin (npr. His, Cys). Metoda je zelo učinkovita pri proteinih, konjugiranih s polihistidinskim podaljškom, saj se le-ta z več hkratnimi in močnimi koordinacijskimi vezmi veţe na imobiliziran kovinski kation Ni 2+. Nosilec pri IMAC metodi predstavljajo delci agaroze, ki imajo na površini kovalentno vezane skupine za kompleksacijo kovinskih ionov, kot je npr. tetradentatna nitrilotriacetatna skupina (NTA), ki zagotavlja močno vezavo Ni 2+ ionov (slika 5). 27

39 Slika 5: Shematski prikaz vezave rekombinantnega proteina s polihistidinskim repkom na nosilec Ni 2+ -NTA Čiščenje Nano-tag(9)-rBd s kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo (IMAC) Rekombinantni protein Nano-tag(9)-rBd smo se odločili izolirati iz topne frakcije bakterijskega lizata in prečistiti s kromatografskimi postopki. V prvi stopnji smo se posluţili kovinsko-kelatne afinitetne kromatografije (IMAC) z uporabo sistema za tekočinsko kromatografijo za hitro ločevanje proteinov (FPLC) Äkta Explorer 10S, opremljenega s kolono HiTrap IMAC HP volumna 1 ml. Bister lizat smo po dodatku Na-fosfata (do 50 mm) in NaCl (do 300 mm) ter uravnavi ph na 7,4 pri nizkem pretoku (0,5 ml/min) črpali skozi kolono in nato začeli s spiranjem kolone. Pri tem smo vsakič, ko je vrednost absorbance pri 280 nm (A 280 ) padla pod 0,1, trikrat stopenjsko zvišali koncentracijo imidazola v pufru za spiranje (50 mm Na-fosfat, 300 mm NaCl, ph 7,4), in sicer do 12,5, 25 in 37,5 milimolarne koncentracije (zelena črta na kromatogramu, slika 12). V zadnjem koraku smo protein eluirali s spiranjem kolone z 250 mm imidazolom v pufru za spiranje. Med celotnim potekom čiščenja smo zbirali frakcije volumna 0,5 ml Gelska izključitvena kromatografija (gelska filtracija) Z gelsko filtracijo ločujemo proteine na podlagi velikosti in/ali oblike. Zmes proteinov nanesemo na kolono, napolnjeno s poroznimi delci majhnih velikosti. Med potovanjem največji proteini potujejo mimo delcev, manjši pa vstopajo v pore, ki so ravno tako različnih velikosti. Najmanjši proteini lahko vstopajo v vse pore, zato skozi kolono potujejo najpočasneje. Boljšo ločbo omogočajo daljše in oţje kolone, pri katerih laţje zagotovimo enakomeren pretok skozi celoten presek. V drugi stopnji smo se odločili združene in koncentrirane frakcije eluatov po kromatografiji IMAC dodatno prečistiti še z gelsko izključitveno kromatografijo (gelsko filtracijo). Pri tem smo uporabili sistem FPLC Äkta Explorer 10S, opremljen s kolono Superdex /300 GL (volumen polnila ~ 24 ml), pri čemer smo na kolono ekvilibrirali s pufrom PBS ph 7,4, ki 28

40 smo ga uporabljali tudi za spiranje oz. elucijo. Na kolono smo nanesli po 0,5 ml vzorca in nadaljevali s spiranjem ob konstantnem pretoku 0,5 ml/min. Pri tem smo kontinuirano spremljali vrednost A 280 in zbirali frakcije volumna 0,5 ml Formiliranje aminskih skupin rekombinantnega proteina na koloni za IMAC Stekleno kolono (priprava le-te je enaka kot pri običajni IMAC kromatografiji) smo napolnili z 1 ml kromatografskega nosilca HIS-Select Nickel Affinity Gel in ga ekvilibrirali z ekvilibracijskim pufrom 2 (0,1 M NaHCO 3 s ph 10). Nato smo v prazen nanašalni del gela nanesli prečiščen vzorec proteina (5-6 mg rekombinantnega fuzijskega proteina Nano-tag(9)- rbd), spustili skozi kolono ter ob tem zbirali nevezano frakcijo (FT). Sledilo je spiranje kolone s ~5 ml 0,1 M Na-karbonata in ~5 ml 10 mm Na-karbonata (oba s ph 10) ter dodatno spiranje še s 5-10 ml organskega topila N,N-dimetilformamid (DMF). Nato smo skozi kolono spustili ~5 ml 1 M raztopine 2,2,2-trifluoroetilformata (TFEF) in ob koncu pretok ustavili ter pustili reakcijo potekati še preko noči pri 4 C. Sledilo je spiranje s ~5 ml 0,1 M Na-karbonata ter nato še s ~10 ml PBS. Vezane proteine smo s kolone eluirali z 250 mm raztopino imidazola ter pri tem zbirali posamezne frakcije po 200 µl Spektrofotometrično določanje koncentracije proteinov Raztopina čistega proteina kaţe značilen absorbcijski spekter z dvema značilnima vrhovoma; pri 220 nm je absorbcijski vrh peptidne vezi sicer višji, vendar v tem območju absorbirajo svetlobo tudi mnoge druge snovi, ki jih pri delu uporabljamo; medtem ko pri 280 nm absorbirajo svetlobo samo aromatske skupine aminokislin, predvsem triptofan in tirozin. Za rutinsko spektrofotometrično določevanje koncentracije proteinov zato uporabljamo valovno dolţino 280 nm. Prednost uporabe metode je predvsem v njeni enostavnosti ter nedestruktivnosti (vzorec po meritvi ostane nespremenjen). Ob poznavanju molarnega absorbcijskega koeficienta lahko koncentracijo proteina izračunamo neposredno iz Beer- Lambertovega zakona. Enačba 1: Beer-Lambertov zakon A c l A absorbanca ε molarni absorpcijski koeficient [L/mol cm] c molarna koncentracija [mol/l] l dolţina optične poti [cm] Absorbance eluiranih frakcij smo po izolaciji proteinov izmerili pri valovni dolžini 280 nm, izračunali koncentracijo po Beer-Lambertovem zakonu, pri tem pa smo uporabili teoretične 29

41 absorbcijske koeficiente (A 0,1 % pri 280 nm =0,759 L/g*cm), izračunane s pomočjo spletne aplikacije Protein Calculator [31] in ProtParam [32] Analiza proteinov s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti NaDS(SDS- PAGE) in detekcija proteinov v gelu S poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata (NaDS-PAGE, ang. SDS-PAGE) ločujemo denaturirane proteine na osnovi razlik v dolţini polipeptidne verige. Proteine pred analizo denaturiramo z dodatkom reducenta (2-merkaptoetanol ali DTT), ki cepi disulfidne vezi, in NaDS, anionskega detergenta, ki se nespecifično veţe na proteine, s čimer jim podeli negativni naboj, in jih denaturira (»razvije polipeptidno verigo«). Pri ločevanju nabiti delci potujejo skozi rešeto polimeriziranega akrilamida, ki je prečno premreţen z N,N -metilenbisakrilamidom, pri čemer je gel je sestavljen iz dveh delov: ločevalnega (spodnjega) ter koncentracijskega ali zbiralnega (zgornjega) gela, ki je manj zamreţen, zato ne ovira molekul pri potovanju. Vzorcem pred nanosom v»ţepke«dodamo nanašalni pufer, ki med drugim vsebuje glicerol (le-ta omogoča lepše usedanje vzorca v ţepek) ter barvilo bromfenolmodro, ki potuje hitreje kot proteini, zaradi česar sluţi kot eletroforezna fronta. Ob priključitvi elektroforeznega sistema na napetost začnejo negativno nabiti proteini potovati proti anodi, pri čemer potujejo manjši proteini hitreje kot večji. Poleg vzorcev na gel nanesemo še označevalec velikosti, ki pomaga pri oceni relativne molekulske mase proteina v vzorcu. NaDS-PAGE smo izvajali po (testnem) izražanju proteinov in po vsakem koraku čiščenja. Vzorcem smo pred nanosom na gel dodali 1/3 končnega volumna nanašalnega pufra, z 4 % (w/v) NaDS, in 1/6 končnega volumna 1M raztopine DTT ter jih 3-4 min inkubirali v vodni kopeli (100 C). Na gel smo nanesli vzorce ter proteinski označevalec velikosti. Elektroforeza je potekala 1,5 h v Tris-glicinskem elektroforeznem pufru pri napetosti 90 V. Ko je barvilo bromfenolmodro pripotovalo do spodnjega roba, smo elektroforezo ustavili. Sledilo je barvanje gelov s Coomassie modrim ter fotografiranje ali izvedba prenosa western Barvanje gelov s Coomassie modrim Po končani elektroforezi smo določili poloţaj proteinov v gelu s pomočjo barvanja z barvilom Coomassie modrim (ang. Brilliant Blue), ki se nespecifično veţe predvsem na bazične in aromatske aminokisline (lizin, arginin, histidin), jih obarva ter na tak način omogoča njihovo vizualizacijo. Ob hkratnem dodanem označevalcu velikosti lahko ocenimo velikost našega 30

42 proteina. Gel po elektroforezi najprej potopimo v 0,1 % (m/v) raztopino barvila, odvečno barvilo pa nato speremo z raztopino za razbarvanje [33]. Gele smo potopili v raztopino za barvanje in postavili na stresalnik. Po eni uri smo gel prenesli v raztopino za razbarvanje, jo nekajkrat zamenjali in gel še fotografirali Prenos western Prenos western uporabljamo kot specifični način detekcije proteinov, ki temelji na imunološki interakciji med iskanim proteinom ter protitelesi, ki ta protein prepoznajo. Proteine po ločitvi z NaDS-PAGE z gela prenesemo s pomočjo električnega toka ali kapilarnega vleka na trden nosilec, kot je nitrocelulozna ali najlonska membrana, na katero se proteini močno veţejo preko nespecifičnih hidrofobnih interakcij. Po blokiranju nezasedenih mest na membrani (na ta način preprečimo nespecifično adsorpcijo protiteles) imobilizirane proteine izpostavimo najprej primarnim in nato še označenim sekundarnim poliklonskim ali monoklonskim protitelesom. Kompleks antigen-protitelo detektiramo radiografsko, kromogeno ali kemiluminiscentno, odvisno od konjugacije sekundarnih protiteles. Po končani elektroforezi smo poliakrilamidni gel za nekaj časa potopili v pufer za prenos western ter odstranili koncentracijski gel, medtem pa smo nitrocelulozno membrano omočili v pufru za prenos western. Dobro omočene komponente smo na anodni plošči sestavili v enoto za prenos v sledečem vrstnem redu: staničevina, trije filter papirji, nitrocelulozna membrana, poliakrilamidni gel, trije filter papirji, staničevina, nato smo jih pokrili s katodno ploščo ter zložili v kadičko. Prenos je potekal 1,5 ure pri konstantni napetosti 100 V. Po končanem prenosu smo membrano inkubirali v blokirni raztopini (5 % mleko/0,05 % PBST) preko noči pri 4 C ter stresanju (50 vrt./minuto). Sledilo je spiranje s pufrom za spiranje (0,05 % PBST) in inkubacija s steptavidinskim konjugatom (SA-HRP, redčen v razmerju 1:2000 v 2 % BSA/0,05 % PBST) 1,5 ure pri sobni temperaturi in stresanju 250 vrt./minuto. Nespecifično vezan streptavidin smo sprali ter membrano za 5 minut inkubirali s kemilumiscenčnim substratom Super Signal West Dura Extended Duration Substrate ter nato s pomočjo sistema za fotografiranje gelov in membran G-box fotografirali membrano (ekspozicija 30 s do 5 min). Drugo različico prenosa western smo izvajali po podobnem principu. Po prenosu smo membrano inkubirali v blokirni raztopini (5 % mleko/0,05 % PBST) preko noči pri 4 C ter stresanju (50 vrt./minuto). Sledilo je spiranje s pufrom za spiranje (0,05 % PBST) in 31

43 inkubacija rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd s primarnimi poliklonskimi zajčjimi protitelesi AntiHis, ki so usmerjena proti histidinskemu podaljšku (AntiHis, redčen v razmerju 1:5000 v 2 % BSA/0,05 % PBST) 1,5 ure pri sobni temperaturi in stresanju 250 vrt./minuto. Nespecifično vezana poliklonska protitelesa smo sprali (0,05 % PBST) ter membrano inkubirali s sekundarnimi kozjimi protitelesi proti humani regiji Fc IgG, konjugirana s hrenovo peroksidazo. Sledilo je spiranje ter inkubacija membrane s kemilumiscenčnim substratom Super Signal West Dura Extended Duration Substrate za 5 minut, nato pa smo s pomočjo sistema za fotografiranje gelov in membran G-box fotografirali membrano (ekspozicija 30 s do 5 min) Določitev N-končnega zaporedja proteina (aminokislinsko sekvenciranje) Aminokislinsko sekvenciranje je ciklično ponavljajoča se metoda, ki temelji na Edmanovi razgradnji, kemijski reakciji pri katerem Edmanov reagent v bazičnem mediju reagira z aminsko skupino N-končne aminokisline, jo odcepi in s tem peptid skrajša za eno aminokislino. Po vsaki stopnji reakcije proste aminokisline ločimo in identificiramo s HPLC. Vzorec izoliranega rekombinantnega proteina smo poslali na Inštitut Jožef Stefan, kjer so nam določili zaporedje prvih petih aminokislin Liofilizacija Liofilizacija ali sušenje z zamrzovanjem je postopek, ki omogoča odstranitev vode iz vzorcev bioloških ali organskih snovi, ki bi jih s segrevanjem uničili, saj se pri procesu liofilizacije ohrani struktura in sestava snovi. Temelji na sublimaciji vode iz zamrznjenega vzorca. Vzorce očiščenega rekombinantnega proteina smo liofilizirali z namenom, da smo odstranili vodo pred poskusi reakcije formiliranja z reagentom TFEF v raztopini Encimsko-imunski test (ELISA) Encimsko-imunski test uporabljamo za kvalitativno določevanje prisotnosti antigena/protiteles v vzorcu ali pa za kvantitativno določevanje koncentracije antigena/protiteles v vzorcu ob uporabi standarda. Eno od protiteles je specifično za antigen, drugo reagira s kompleksom antigen-primarno protitelo in ima vezan encim, ki omogoči pretvorbo kromogenega, kemiluminiscenčnega ali flourogenega substrata v specifičen produkt, ki omogoča detekcijo. Z encimsko-imunskim testom smo preverjali funkcionalnost oziroma sposobnost vezave rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd na SA-HRP, kamor se veže peptidni podaljšek 32

44 Nano-tag(9), ali regijo Fc-protiteles, kamor se veže domena B. V ta namen smo izvedli več različnih testov ELISA. V vseh primerih smo nanesli pozitivno in negativno kontrolo ELISA 1 V prvi stopnji smo v vdolbinice mikrotitrske ploščice v prvem stolpcu adsorbirali regijo Fc v koncentraciji 10 µg/ml, v drugi stolpec smo v vdolbinice od A2-D2 adsorbirali goveji serumski albumin (BSA), medtem ko smo v vdolbinici E2 in F2 adsorbirali biotiniliran goveji serumski albumin (B-BSA). Vse smo inkubirali preko noči v hladilniku s stalnim stresanjem 50 vrt./min. Nezasedene površine smo blokirali s 5 % posnetim mlekom v prahu v PBS in jih inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi in stalnem stresanju 50 vrt./minuto. Sledilo je trikratno spiranje s 0,1 % PBST. Nato smo v posamezne vdolbinice dodali celične lizate topnih frakcij po naslednji shemi: Tabela V: Razporeditev dodatka celičnih lizatov ter kontroli na mikrotitrski ploščici. 1 2 A 37 C, IND. 37 C,IND. B 37 C, NE IND. 37 C, NE IND. C 30 C, IND. 30 C, IND. D 30 C, NE IND. 30 C, NE IND. E / F / Trikratnemu spiranju s 0,01 % PBST je sledil dodatek samega konjugata SA-HRP ali SA- HRP v kombinaciji z biotinom, in sicer po naslednji shemi: Dodatek raztopine SA-HRP Dodatek raztopine SA-HRP+biotin in inkubiranje za 1 uro na sobni temperaturi in stalnem stresanju 50 vrt./min. Sledilo je štirikratno spiranje z 0,1 % PBST ter detekcija s substratom TMB. Hrenova peroksidaza katalizira oksidacijo TMB do modro obarvanega produkta. Po 15 minutah smo v vdolbinice dodali po 50 μl 2 M raztopine H 2 SO 4, na ta način zaustavili encimsko reakcijo in izmerili absorbanco rumeno obarvanih raztopin pri valovni dolţini 450 nm ELISA 2- preverjanje funkcionalnosti Nano-tag(9)-rBd v vzorcih prečiščenega proteina V prvi stopnji smo v vdolbinice C1-H1 mikrotitrske ploščice adsorbirali rekombinantni protein, očiščen z gelsko filtracijo (glej shemo), v A1 smo adsorbirali biotiniliran leptin (B- LEP), medtem ko v vdolbinico B1 nismo adsorbirali ničesar. Sledila je inkubacija preko noči 33

45 v hladilniku in stalnem stresanju 50 vrt./min. Nezasedene površine smo blokirali s 5 % posnetim mlekom v prahu v PBS 1 uro. Sledilo je trikratno spiranje z 0,1 % PBST. Tabela VI: Razporeditev vzorcev rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd ter kontroli na mikrotitrski ploščici. 1 A B-lep B / C B9 (poskus 1) D B9 (poskus 1) E B9 (poskus 2) F B9 (poskus 2) G B9 (poskus 1) H B9 (poskus 2) Vzorec B9 predstavlja vzorec rekombinantnega proteina z najvišjo koncentracijo po čiščenju s kromatografijo IMAC. Na koncu smo dodali v posamezne vdolbinice sam SA-HRP, SA-HRP v kombinaciji z biotinom ali s HRP označena monoklonska protitelesa in sicer po naslednji barvni shemi: Dodatek raztopine SA-HRP Dodatek raztopine SA-HRP+biotin Dodatek raztopine mab-anti-m13-hrp in inkubirali 1 uro na sobni temperaturi in stalnem stresanju 50 vrt./min. Sledilo je štirikratno spiranje z 0,01 % PBST ter detekcija z uporabo substrata TMB po opisanem postopku pri ELISI ELISA 3- preverjanje funkcionalnosti Nano-tag(9)-rBd po reakciji formiliranja V prvi stopnji smo v vdolbinice mikrotitrskih ploščic adsorbirali proteine po spodnji shemi in inkubirali preko noči v hladilniku in stalnem stresanju (50 vrt./min). Nezasedene površine smo blokirali s 5 % posnetim mlekom v prahu v PBS in jih inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi in stalnem stresanju 50 vrt./min. Sledilo je trikratno spiranje z 0,1 % PBST. Tabela VII: Razporeditev vzorcev rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd ter kontroli na mikrotitrsko ploščico A B C D E 1 Nano-tag(9)-rBd (po formiliranju.) ~90 µg/ml Nano-tag(9)-rBd (po formiliranju) ~ 35 µg/ml Nano-tag(9)-rBd (pred formiliranjem) ~ 100 µg/ml BSA B-hLEP 34

46 Sledilo je trikratno spiranje z 0,1 % PBST. Dodali smo raztopino SA-HRP (rečen v razmerju 1:2000) v 1 % BSA/0,05 % PBST ter inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi in stalnem stresanju (50 vrt./min). Po štirikratnem spiranju z 0,1 % PBST smo izvedli detekcijo s substratom TMB po opisanem postopku pri ELISI ELISA 4- preverjanje funkcionalnosti Nano-tag(9)-rBd po reakciji formiliranja na koloni IMAC V prvi stopnji smo v vdolbinice mikrotitrske ploščice adsorbirali proteine po spodnji shemi in vse inkubirali preko noči v hladilniku in stalnem stresanju (50 vrt./min). Nezasedene površine smo blokirali s 5 % posnetim mlekom v prahu v PBS ter jih inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi in stalnem stresanju 50 vrt./minuto. Sledilo je trikratno spiranje z 0,1 % PBST. Dodali smo lizate izoliranega ter modificiranega rekombinantnega proteina pred formiliranjem (pred f.) in vzorce po formiliranju (po f.) po naslednji shemi: Tabela VIII: Razporeditev vzorcev rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd ter kontroli na mikrotitrski ploščici. 1 2 A SA//Nano9-rBd (po f.) Anti-His// Nano9-rBd (po f.) B SA// Nano9-rBd (po f.) Anti-His// Nano9-rBd (po f.) C BSA// Nano9-rBd (po f.) BSA// Nano9-rBd (po f.) D SA// Nano9-rBd (pred f.) Anti-His// Nano9-rBd (pred f.) E SA// Nano9-rBd (pred f.) Anti-His// Nano9-rBd (pred f.) F BSA//Nano9-rBd (pred f.) BSA// Nano9-rBd (pred f.) G Nano9-rBd (pred f.)// 0 Fc// Nano9-rBd (po f.) H SpA//0 Fc// Nano9-rBd (pred f.) Sledilo je trikratno spiranje z 0,1 % PBST ter dodatek SA-HRP, SA-HRP v kombinaciji z biotinom, ali monoklonskega protitelesa, konjugiranega s HRP po naslednji barvni shemi: Dodatek raztopine SA-HRP Dodatek raztopine SA-HRP+biotin Dodatek raztopine mab-anti-m13-hrp Inkubacija je potekala 1 uro pri sobni temperaturi in stalnem stresanju (50 vrt./min). Po štirikratnem spiranju z 0,1 % PBST smo izvedli detekcijo s substratom TMB po opisanem postopku pri ELISI 1. 35

47 Test točkovnega nanosa (Dot-blot) Točkovni nanos (ang. dot blot) je kvalitativna metoda, ki jo uporabljamo za hitro določanje prisotnosti določenega antigena na membrani brez predhodne ločitve s pomočjo NaDS- PAGE. Vzorce direktno nanesemo na nitrocelulozno membrano, pri čemer se proteini veţejo preko močnih nekovalentnih interakcij Točkovni nanos 1 Raztopine posameznih denaturiranih vzorcev za nanos smo pripravili iz: 0,5 µl vzorca rekombinantnega proteina + 4,5 µl PBS + 4 µl reakcijske mešanice (DTT + NaDS) ter mešanice 3 minute inkubirali v vodni kopeli (100 C). Pri ne denat. paralelah smo postopali po enakem principu, le da smo namesto reakcijske mešanice (DTT + NaDS) dodali enak volumen PBS. Vzorce smo nanesli na nitrocelulozno membrano po naslednji shemi: Tabela IX: Razporeditev vzorcev rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd ter kontrol na nitrocelulozni membrani. B9-1 [2 µl] denat. B9-1[2 µl] ne denat. B9-1 [0,5 µl] denat. B9-1 [0,5 µl] ne denat. B9-2 [2 µl] denat. B9-2 [2 µl] ne denat. B9-2 [0,5 µl] denat. B9-2 [0,5 µl] ne denat. NK (BSA) denat. PK (B-lep) ne denat. PK (B-lep) denat. NK (BSA) ne denat. Vzorec B9 predstavlja vzorec z najvišjo koncentracijo proteina (določeno s spektrofotometrično metodo) po čiščenju z gelsko filtracijo, medtem ko številki (1 in 2) prestavljata različna vzorca proteina po gelski filtraciji. Izraz denat. pomeni, da je bil protein denaturiran z DTT in NaSD, medtem ko izraz ne denat. pomeni, da je vzorec nativen oz. intakten. Oznaka PK predstavlja pozitivno kontrolo, oznaka NK pa negativno kontrolo. Membrano smo po nanosu posušili pri sobni temperaturi. Nato smo blokirali nezasedene površine na membrani s 5 % posnetim mlekom v prahu v 0,05 % PBST 1 uro pri sobni temperaturi ter stalnem stresanju. Membrano smo trikrat sprali z 0,1 % PBST ter dodali raztopino SA-HRP (1:2000) v 1 % BSA/0,05 % PBST in inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi in stalnem stresanju. Sledilo je ponovno spiranje membrane z 0,1 % PBST ter inkubacija s kemilumiscenčnim substratom Super Signal West Dura Extended Duration Substrate v obdobju 5 minut ter fotografiranje membrane s pomočjo sistema G-box (ekspozicija 30 s do 5 min) Točkovni nanos 2 Vzorce smo nanesli na nitrocelulozno membrano po naslednji shemi: 36

48 Tabela X: Razporeditev vzorcev rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd po formiliranju ter kontroli na nitrocelulozni membrani PK [1 µl] B-lep NK [2 µl] FAG-HPQ H 2 0¹ [2 µl] 5 ekv THF² [5 µl] 5 ekv THF¹ [5 µl] 1ekv H 2 0² [2 µl] 1 ekv / / H 2 0 [5 µl] slepa Oznaka THF pomeni, da smo vzorec rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd podvrgli reakciji z reagentom TFEF v organskem topilu THF, medtem ko oznaka vzorca H 2 O pomeni, da smo formiliranje Nano-tag(9)-rBd izvajali z reagentom TFEF v vodnem mediju. Vsi nadaljnji postopki so enaki opisanim v poglavju Točkovni nanos 1 ( ) Kemijska modifikacija proteina S kemijsko modifikacijo smo skušali doseči predvsem formiliranje končnih aminskih skupin v rekombinantnem proteinu Nano-tag(9)-rBd, pri čemer smo uporabili dva načina, opisana v nadaljevanju (opisano v poglavjih in ) Formiliranje Nano-tag(9)-rBd s TFEF (2,2,2-trifluoroetilformat) V dve izmed kriovial z liofiliziranim proteinom Nano-tag(9)-rBd smo dodali reagent TFEF, raztopljen v topilu THF, v dveh različnih koncentracijah. V prvo smo dodali 3,33 µl reagenta TFEF (z molekulsko maso 128,05 g/mol in gostoto 1,317 g/ml) in 2 ml THF, v drugo smo dodali 15,85 µl TFEF ter enako količino topila THF. V reakcijsko mešanico smo dodali tudi K 2 CO 3 z namenom naalkaljenja zmesi. V drugi dve krioviali smo dodali v vsako 40 µl vode ter v prvo 1,19 µl reagenta TFEF, v drugo 6 µl reagenta TFEF in v obe dodatek K 2 CO 3, z enakim namenom. Funkcionalnost produkta smo preverili s točkovnim nanosom na membrano ( ). 37

49 4. SHEMA POTEKA EKSPERIMENTALNEGA DELA 4.1 SHEMA PRIPRAVE EKSPRESIJSKEGA VEKTORJA Izolacija plazmidnega vektorja pet-28/b_insert ( ) Dvojno rezanje pet-28/b_insert z NcoI in SacII ( ) Agarozna gelska elektroforeza ter detekcija ( ) Izolacija rezanega plazmida iz koščka gela ( ) Hibridizacija sinteznih oligonukleotidov ( ) Ligacija inserta Nano-tag(9) (NcoI/SacII) v vektor pet-28/b_insert ( ) Transformacija bakterij E. coli Top10 z ligacijsko zmesjo in s pomočjo toplotnega šoka ( ) PCR na osnovi kolonije ( ) Agarozna gelska elektroforeza ( ) Priprava prekonočnih bakterijskih kultur ( ) in izolacija plazmidne DNA ( ) Določitev nukleotidnega zaporedja konstrukta ( ) Transformacija bakterij E. coli BL21(DE3) plyss z izolirano plazmidno molekulo DNA s pomočjo toplotnega šoka ( ) 4.2. SHEMA IZRAŢANJA, IZOLACIJE IN ČIŠČENJA REKOMBINANTNEGA PROTEINA Testno izraţanje pri 30 C in 37 C ( ) Analiza nivoja izraţanja rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd z NaDS-PAGE ( ) Barvanje s Coomassie modrim ( ) in izvedba prenosa western ( ) Preverjanje funkcionalnosti rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd s testom ELISA ( ) 38

50 Izraţanje proteina Nano-tag(9)-rBd v večjem volumnu ( ) Čiščenje s kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo (kromatografija IMAC) ( ) NaDS-PAGE in barvanje s Coomassie modrim( ) Čiščenje z gelsko filtracijo( ) NaDS-PAGE in barvanje s Coomassie modrim ( ) Preverjanje funkcionalnosti Nano-tag(9)-rBd z ELISA ( ) in točkovnim nanosom ( ) 4.3. SHEMA POTEKA POSKUSOV KEMIJSKEGA MODIFICIRANJA REKOMBINANTNEGA PROTEINA Nano-tag(9)-rBd Poskus formiliranja Nano-tag(9)-rBd z reagentom TFEF v vodnem in brezvodnem mediju ( ) Preverjanje uspešnosti poteka reakcij s točkovnim nanosom ( ) Poskus formiliranja s TFEF na koloni IMAC ( ) Spektrofotometrično določanje koncentracije proteinov ( ) Poskus detekcije izoliranega in uspešno formiliranega proteina z encimsko-imunskim testom ( ) 39

51 5. REZULTATI IN RAZPRAVA 5.1. Načrtovanje kloniranja Nano-tag(9) v ekspresijski sistem pet- 28/B_insert Genski konstrukt za modelni protein Nano-tag(9)-rBd smo pripravili v vektorju pet- 28/B_insert, v katerem je bil ţe predhodno vstavljen gen za B-SpA skupaj z uvedenim restrikcijskim mestom za SacII tik pred njim [26]. Nukleotidno zaporedje izhodnega konstrukta je podano v prilogi 2. Glede na zadovoljivo afiniteto do streptavidina [13] smo izbrali krajšo različico Nano-tag-a z aminokislinskim zaporedjem DVEAWLGAR, saj jo pogosteje uporabljajo za visoko občutljive metode za detekcijo rekombinantnih proteinov ter interakcij z drugimi molekulami [34]. Nano-tag(9) smo uvedli na N-konec B-SpA z vmesnim povezovalcem, ki omogoča večjo dostopnost fuzijskega partnerja do vezavnega mesta streptavidina. Pri načrtovanju oligonukleotidov smo klonirali Nano-tag(9) v vektor pet-28/b_insert preko restrikcijskih mest NcoI in SacII. Po kloniranju in silico in analizi prepisane mrna smo ugotovili tudi, da ribosomsko vezavno mesto (ang. ribosome binding site ali RBS) in začetni kodon AUG verjetno ne sodelujeta pri tvorbi višjih struktur (zank oz. lasnic) in sta primerno izpostavljena za prepoznavo z ribosomi Virtualno kloniranje kloniranje Nano-tag(9) v vektor pet-28/b_insert (preko NcoI in SacII) ccatggatggatgtggaagcgtggctgggcgcgcgctccgcgggcggtggaagtgctgataa M D V E A W L G A R S A G G G S A D N caaattcaacaaagaacaacaaaatgctttctatgaaattttacatttacctaacttaaatg K F N K E Q Q N A F Y E I L H L P N L N E aagagcaacgcaatggtttcatccaaagcttaaaagatgacccaagccaaagcgctaacctt E Q R N G F I Q S L K D D P S Q S A N L ttagcagaagctaaaaagctaaatgatgcacaagcaccaaaactcgagcaccaccaccac L A E A K K L N D A Q A P K L E H H H H caccactga H H - Z rumeno barvo je označeno restrikcijsko mesto za NcoI, z vijolično pa restrikcijsko mesto za SacII. Odebeljene in poudarjene črke predstavljajo začetni (atg) ter končni kodon (tga). Zeleno obarvani del predstavlja insert Nano-tag(9), medtem ko oranţna barva prikazuje vmesni povezovalec med obema fuzijskima partnerjema. Modra barva prikazuje domeno B, rdeča pa afinitetni podaljšek s šestimi histidinskimi ostanki (His-tag). 40

52 Slika 6: Predstavitev predvidene strukture rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd [35]. S puščico je označeno mesto pripenjanja afinitetnega podaljška Nano-tag(9) Molekulsko kloniranje Restrikcija pet-28/b_insert z restrikcijskima endonukleazama NcoI in SacII Vektor pet-28/b_insert smo rezali z restrikcijskima endonukleazama NcoI in SacII ter produkt analizirali in ločili od drugih komponent restrikcijske zmesi s pomočjo agarozne elektroforeze (slika 7). 41

53 Slika 7: Slika agaroznega gela po restrikciji pet-28/b_insert z restrikcijskima endonukleazama NcoI in SacII. Na gel smo nanesli (od leve proti desni): restrikcijsko zmes, označevalec velikosti Gene Ruler TM 1 kb (M) ter nerezan vektor pet-28/b_insert. Na sliki na mestu okoli 5420 bp, kjer pričakujemo odprt plazmid, je luknja, saj smo gel z rezano plazmidno DNA izrezali ter vektor izolirali s pomočjo kompleta QIAEX II. Izrezan fragment DNA je premajhen (pribliţno 10 bp), da bi ga lahko zaznali v agaroznem gelu. Na sliki lahko vidimo, da je restrikcija uspešno potekla, saj se lisa odprtega vektorja nahaja med 5000 in 6000 bp. Izoliran odprt vektor smo ligirali s hibridiziranima oligonukleotidoma F_cod_Nano9_Bins in R_nc_Nano9_Bins. V kompetentne bakterijske celice E. coli Top10 smo vnesli plazmide z ligacijsko zmesjo. Selekcijo transformiranih celic smo izvedli z gojenjem na selekcijskem agarnem gojišču LB z dodanim kanamicinom do končne koncentracije 35 µg/ml. Ker plazmid nosi zapis za odpornost proti kanamicinu, so na gojišču zrasle le tiste celice, ki so plazmid sprejele. Da bi preverili ustrezno prisotnost ţelenega inserta v plazmidu, smo izvedli PCR na osnovi kolonije. Pričakovan produkt reakcije PCR na osnovi kolonije v primeru pravilno vstavljenega inserta, kjer smo kot začetna oligonukleotida uporabili R-XhoI ter T7, je dolg 315 bp. Produkte smo analizirali z agarozno gelsko elektroforezo (slika 8). 42

54 Tabela XI: Shematski prikaz pomena kratic pri nanosu vzorcev na agarozni gel M-50bp PK1 PK PK NK marker Gene produkti PCR na osnovi petih pet28- Ligacijska Ligacijska dotik Ruler 50 bp različnih kolonij B_insert zmes zmes agarja DNA Ladder Slika 8: Slika agaroznega gela po reakciji PCR na osnovi kolonije. Pri pozitivni kontroli 1 (izvorni vektor pet-28/b_insert) smo pričakovali liso pri 294 bp, kjer se tudi nahaja. Pri obeh pozitivnih kontrolah (ligacijski zmesi, označeni s kratico PK) bi v idealnem primeru pričakovali le liso pri 315 bp, ki je bila sicer prisotna, vendar smo opazili dodatni lisi pri ~ 250 bp in ~ 400 bp, kar je lahko posledica napačnih ligacij (več sočasno nastalih ligacijskih produktov, med katerimi je le en ustrezen). Pri negativni kontroli nismo zaznali nobenih produktov, kar pomeni, da je verjetnost nastajanja produktov ob odsotnosti dotika kolonij nizka. Lise produktov reakcij PCR na osnovi petih različnih kolonij (na sliki 8 označene od 1 do 5) smo pričakovali pri 315 bp. Pri produktu PCR kolonije številka 5 smo opazili dve lisi pri ~ 250 bp in ~ 400 bp, enako kot pri ligacijski zmesi, zaradi česar lahko posumimo na nepravilno ligacijo. Zato kolonije številka 5 v nadaljnjem delu nismo uporabili. Iz slike je razvidno, da smo dobili produkt ustrezne dolţine pri prvih štirih kolonijah (1 do 4). 43

55 Da smo se prepričali o ustreznosti inserta, smo kolonijam številka 3 in 4 izolirali plazmidno DNA in določili nukleotidno zaporedje. Izoliranima plazmidoma z vstavljenim konstruktom Nano-tag(9) iz kolonije številka 3 in 4 smo koncentracijo in čistost določili spektrofotometrično. Tabela XII: Rezultati določitve koncentracije in čistosti izoliranih plazmidov Nano-tag(9)- rbd s spektrofotometrom NanoDrop. ime A 260 A 260 /A 280 c [ng/µl] MP 2 3 1,086 1,74 54,3 MP 4 1,138 1,72 56,9 Raztopina čiste molekule DNA ima razmerje A 260 /A 280 1,8. Vzorca izolirane plazmidne molekule DNA (MP 3 in MP 4) imata vrednost nekoliko niţjo, kar nakazuje na prisotnost majhne količine proteinskih nečistot Določitev nukleotidnega zaporedja Izoliranima plazmidnima DNA iz vzorcev MP3 in MP4 smo potrdili pričakovano nukleotidno zaporedje Testno izraţanje proteina Testno izraţanje proteina smo izvajali v štirih paralelah, tako da smo dve paraleli bakterijske kulture E. coli BL21(DE3) plyss, ki smo jo transformirali s plazmidom pet-28/b_insert- Nano-tag(9), inducirali z dodatkom IPTG, drugi dve pa ne. Po eno inducirano in neinducirano paralelo smo izpostavili različnima temperaturama (30 C in 37 C). Zrasle celice na gojišču smo izolirali, sprali s PBS ter lizirali z zamrzovanjem ter sledečo sonikacijo z ultrazvočno sondo. Dobljene celične lizate smo ločili na topne in netopne frakcije ter celične proteine ločili z NaDS-PAGE in na gelu po nespecifičnem barvanju ali na membrani po prenosu western opazovali prisotnost rekombinantnega proteina (sliki 9 in 10). 2 MP je kratica za»minipreparacijo«, produkt izolacije plazmidne molekule DNA, številka predstavlja številko kolonije iz katere smo izolirali plazmidno DNA molekulo. 44

56 Slika 9: Slika ločbe celičnih proteinov na gelu s NaDS-PAGE po testnem izraţanju. Barvanje s Coomassie modrim. Nanosi na gel iz desne proti levi: proteinski označevalec velikosti (M) ter frakcije celičnih proteinov. Kratica TF pomeni topno proteinsko frakcijo, NTF pomeni netopno proteinsko frakcijo, IND inducirano kulturo, NEIND pa neinducirano kulturo. Izračunana molekulska masa izraţenega rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd je 9,2 kda, zato smo pričakovali pripadajočo liso med lisama 6 kda in 16 kda glede na proteinski označevalec velikosti. Prav tako smo pričakovali liso le pri topnih proteinskih frakcijah iz induciranih kultur. Na sliki 9 sta s puščicama označeni lisi, ki domnevno pripadata rekombinantnemu proteinu. Vidna je namreč zgolj v topnih frakcijah celičnih proteinov induciranih kultur ter je, glede na proteinski označevalec velikosti, primerne velikosti. Ker pri frakcijah neinduciranih kultur nismo opazili lis, smo predvidevali, da je kontrola izraţanja v izbranem ekspresijskem sistemu dobro nadzorovana preko promotorja T7. Bistvene razlike v izraţanju rekombinantnega proteina pri obeh temperaturah nismo opazili, zato smo se odločili, da izraţanje v velikem volumnu izvedemo pri 37 C, pri kateri se bakterije mnoţijo hitreje in je tako za izraţanje proteina potreben krajši čas. Rekombinanten protein v celičnih lizatih smo poskusili po prenosu western na membrano detektirati s protitelesi, ki se specifično veţejo na histidinski podaljšek ter z dodatkom sekundarnih protiteles (slika 10). 45

57 Slika 10: Nitrocelulozna membrana po prenosu western in detekciji rekombinantnega proteina s primarnimi protitelesi AntiHis. Z M je označen poloţaj nanosa proteinskega označevalca velikosti, kot pozitivno kontrolo smo uporabili rekombinantno domeno B stafilokoknega proteina A. Na nitrocelulozni membrani smo poleg pričakovanih lis pri topnih proteinskih frakcijah induciranih kultur opazili lisi tudi pri induciranih netopnih frakcijah, pri čemer smo sklepali, da se je rekombinantni protein izrazil v tolikšni količini, da ga je bilo nekaj tudi netopnega v obliki agregatov ali inkluzijskih telesc. Pri frakcijah neinduciranih kultur nismo opazili lis. Glede na liso pozitivne kontrole (domena B stafilokoknega proteina A) smo opazili, da so lise rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd nekoliko višje. Vzrok za višje lise je, da ima rekombinantni protein Nano-tag(9)-rBd dodan afinitetni podaljšek Nano-tag(9), zaradi česar je protein večji Določevanje funkcionalnosti Nano-tag(9)-rBd (ELISA 1) Sposobnost vezave rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd na Fc-regijo imunoglobulinov G in na streptavidin smo ovrednotili z encimsko-imunskim testom (ELISA). Na dno vdolbinic mikrotitrskih ploščic smo vezali Fc-regijo protiteles, nanje dodali topne frakcije celičnih lizatov ter rekombinantni protein skušali detektirati s konjugatom SA-HRP. 46

58 Absorbanca (450 nm) 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 Slika 11: Rezultati vezave SA-HRP na celične lizate po testnem izraţanju Visok signal smo zasledili le pri pozitivni kontroli (B-BSA/0/SA-HRP). Negativna kontrola (B-BSA/0/SA-HRP+biotin) se ni obarvala, kar pomeni, da je bil test ustrezno izveden. Pri ostalih vdolbinicah nismo zasledili signala, kar pomeni, da se rekombinantni protein z afinitetnim podaljškom Nano-tag(9) ni vezal na regijo Fc ali na streptavidin. Vzrokov za neuspelo vezavo Nano-tag(9) je več, predvidevali smo, da je N-končni»repek«Nano-tag(9) v nativni obliki rekombinantnega proteina morda nedostopen (oviran z domeno B), zaradi česar se ni uspel vezati na streptavidin. Kljub temu da je bil predhodni test vezave na mikrotitrski ploščici negativen, smo se odločili za izraţanje proteina v večjem volumnu in z nadaljnjimi preverjanji sposobnosti vezave afinitetnega podaljška Nano-tag(9) na streptavidin Izraţanje in izolacija rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd Izraţanje rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd v kulturi večjega volumna smo izvajali pri 37 C. Sledilo je čiščenje s kromatografijo IMAC ter analiza kromatografskega procesa z NaDS-PAGE. 47

59 Manual run 9:10_UV1_280nm Manual run 9:10_Conc Manual run 9:10_Fractions mau B3 B5 B7 B9 B11 B13 B15 C2 C4 C6 C8 C10 C12 C14 D1 D3 D5 D7 D9 D11 D13 D15 E2 E4 E6 E8 E10 E12 E14 F1F2F3F4F5F6F7F8F9 F11 F13 F15 G2 G ml Slika 12: Slika predstavlja kromatogram poteka čiščenja Nano-tag(9)-rBd s kromatografijo IMAC. Z modro barvo je označena absorbanca iz kolone izhajajoče raztopine pri 280 nm, z rdečo barvo pa so označene posamezne zbrane frakcije. Z zeleno je označeno stopenjsko višanje koncentracije imidazola med spiranjem in na koncu med elucijo. Slika 13: Analiza izbranih frakcij po čiščenju z IMAC z NaDS-PAGE. Gel smo barvali s Coomassie modrim. Puščice označujejo lise, ki pripadajo rekombinantnemu proteinu Nanotag(9)-rBd. Nanosi na gel so različne eluirane frakcije, zbrane med kromatografijo IMAC. 48

60 Glede na osnovni princip kromatografije smo se v prvi fazi znebili vseh proteinov, ki niso imeli afinitete do nosilca Ni 2+ -NTA, kar nakazuje visoka absorbanca v fazi nanašanja vzorca na kolono (na kromatogramu pri frakciji B8, slika 12). Slika gela po ločitvi proteinov z NaDS-PAGE (slika 13) nam je potrdila, da so se v nevezani frakciji B8 nahajali številni proteini, lise Nano-tag(9)-rBd pa ni zaznati. Rekombinantni protein Nano-tag(9)-rBd se je eluiral po dodatku visoke koncentracije (250 mm) kompetitivnega liganda imidazola, kar smo v kromatogramu zaznali kot vrh pri eluirani frakciji F15. Na sliki poliakrilamidnega gela, barvanega s Coomassie modrim (slika 13), smo opazili prisotnost rekombinantnega proteina Nano-tag(9) v eluiranih frakcijah od F9 do G3 (lise, označene s puščicami). V eluiranih frakcijah smo skupaj s proteinom Nano-tag(9)-rBd na gelu NaDS-PAGE zaznali prisotnost drugih proteinov (proteinske nečistote), zato smo se v nadaljevanju odločili za dodatno čiščenje z gelsko filtracijo. Pred čiščenjem z gelsko filtracijo, smo vzorec rekombinantnega proteina skoncentrirali s pomočjo ultrafiltracije z uporabo centrifugalne enote Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit in nominalno velikostjo por 3 kda. mau SEC BdNano9 run :10_UV1_280nm SEC BdNano9 run :10_Fractions A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A11 A13 A15 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B11 B13 B15 Wa Slika 14: Reprezentativen kromatogram čiščenja rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd z gelsko filtracijo. Posameznim eluiranim frakcijam smo po gelski filtraciji spektrofotometrični določili koncentracijo. Tabela XIII: Absorbance in ocenjene koncentracije rekombinantnega proteina v posameznih frakcijah po gelski filtraciji. Frakcija A 280 Koncentracija [mg/ml] B6 0,072 0,095 B7 0,219 0,289 49

61 B8 0,409 0,539 B9 1,116 1,470 B10 1,469 1,935 B11 0,627 0,826 B12 0,136 0,179 Po gelski filtraciji smo analizirali posamezne zbrane frakcije z NaDS-PAGE ter barvanjem z barvilom Coomassie modrim. S tem smo preverili čistost in ustreznost Nano-tag(9)-rBd. Slika 15: Poliakrilamidni gel po NaDS-PAGE in barvanju s Coomassie modrim: analiza čistosti posameznih frakcij po gelski filtraciji. S pomočjo NaDS-PAGE smo potrdili visoko čistost zbranih frakcij glede na vsebnost rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd. V frakcijah B7 in v frakciji B8 so bile rahlo opazne lise drugih proteinov (nečistot), vendar v frakcijah, kjer je bila koncentracija proteina Nano-tag(9)-rBd najvišja, tj. B10 in B11, nečistot ni bilo opaziti Določitev N-končnega zaporedja proteina Z določitvijo N-končnega aminokislinskega zaporedja smo potrdili prisotnost Nano-tag(9) na rekombinantnem proteinu (glej prilogo številka 3). Dejstvo, da je Edmanova razgradnja potekla, je bilo obenem potrditev, da rekombinantni protein Nano-tag(9)-rBd na N-končnem mestu ni bil formiliran. S kromatografijo IMAC in gelsko filtracijo smo izraţeni Nano-tag(9)-rBd uspešno očistili in z Edmanovo razgradnjo tudi potrdili njegovo pravilno N-končno zaporedje ter na tak način dokazali, da se je načrtovani genski konstrukt pravilno vstavil v ekspresijski sistem ter 50

62 uspešno izrazil. V nadaljevanju nas je zanimalo ali je vstavljen afinitetni podaljšek tudi funkcionalen oziroma sposoben vezave na streptavidin Preverjanje funkcionalnosti Nano-tag(9)-rBd Sposobnost vezave fuzijskega proteina Nano-tag(9)-rBd na streptavidin smo preverili s prilagojeno različico encimsko-imunskega testa (ELISA 2). Na dno vdolbinic smo adsorbirali očiščen rekombinanten protein Nano-tag(9)-rBd ter ga skušali detektirati s streptavidinom z vezano hrenovo peroksidazo (SA-HRP; vdolbinice C do F) ali z imunoglobulinom (anti-m13- mab), konjugiranim s HRP (vdolbinici G in H). 2,5 Absorbanca (450 nm) 2 1,5 1 0,5 0 Slika 16: Rezultati preverjanja funkcionalnosti fuzijskih partnerjev proteina Nano-tag(9)-rBd z encimsko-imunskim testom (ELISA 2). Pri ELISI 2 (slika 16) je vdolbinica A predstavljala pozitivno kontrolo (biotiniliran leptin), kjer smo dobili visok signal v primerjavi z negativno kontrolo, vdolbinica B2 pa negativno kontrolo (zgolj blokirana vdolbinica). S tem smo potrdili ustreznost izvedbe našega preskusa. Funkcionalnost peptidnega podaljška Nano-tag(9) bi potrdilo obarvanje vdolbinic C in E (B9/SA-HRP) v D in F smo namreč dodali še prost biotin a tega nismo zaznali. Moţnih vzrokov za to je več, najprej pa smo predvidevali, da se je afinitetni podaljšek Nano-tag(9) skril v notranjost rekombinantnega proteina in je bila s tem onemogočena vezava na konjugat SA-HRP. Visok signal vdolbinic G in H (B9/mAb-anti-M13-HRP) dokazuje pravilno zvitje fuzijskega partnerja domene B, ki veţe regijo Fc imunoglobulinov G. Po neuspeli detekciji rekombinantnega proteina s testom ELISA smo skušali potrditi vezavo rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd na SA-HRP še s tehniko točkovnega nanosa, pri 51

63 kateri lahko uporabimo večje količine antigena in lahko pred nanosom protein denaturiramo, torej izpostavimo domnevno skriti podaljšek Nano-tag(9). Posamezne vzorce (denaturiran ali nativen rekombinantni fuzijski protein Nano-tag(9)-rBd, BSA in biotiniliran leptin) smo nanesli na nitrocelulozno membrano ter jih skušali detektirati s konjugatom SA-HRP. Slika 17: Preverjanje funkcionalnosti rekombinantnega proteina s točkovnim nanosom (točkovni nanos 1). Oznaka B9 predstavlja vzorec z najvišjo koncentracijo proteina (določeno s spektrofotometrično metodo) po čiščenju z gelsko filtracijo. Številki (1 in 2) predstavljata vzorca proteina Nano-tag(9)-rBd po gelski filtraciji v dveh neodvisnih poskusih čiščenja. Pri točkovnem nanosu sta dali signal le pozitivni kontroli, negativni kontroli pa ne, kar potrjuje ustreznost izvedbe testa. Drugih lis na točkovnem nanosu nismo opazili. Po vseh izvedenih preverjanjih sposobnosti vezave afinitetnega podaljška Nano-tag(9) na streptavidin so bili vsi testi negativni, kar nakazuje na dejstvo, da se afinitetni podaljšek Nano-tag(9) v rekombinantnem proteinu Nano-tag(9)-rBd ne veţe na streptavidin. Za omenjeni razlog smo skušali najti razlago in smo zato dodatno pregledali trenutno znana dognanja o afinitetnemu podaljšku Nano-tag(9). Pri tem smo ugotovili, da je za vezavo na streptavidin pri Nano-tag(9) nujno potreben formiliran metionin na N-koncu proteina [34]. 52

64 Hkrati smo zasledili dejstvo, da se po izraţanju rekombinantnih proteinov v ekspresijskem sistemu E. coli večina formilnih skupin z N-končnega metionina odcepi. To je najverjetnejši razlog, zakaj se afinitetni podaljšek ni vezal na streptavidin. Prav tako smo s potekom Edmanove razgradnje dokazali, da rekombinantni protein na N-koncu ni formiliran. Odsotnost formilne skupine kot razlog za nevezavo fuzijskega proteina na streptavidin smo skušali potrditi tudi tako, da smo rekombinantni protein Nano-tag(9)-rBd poizkusili naknadno formilirati Kemijska modifikacija proteina S kemijsko modifikacijo smo skušali formilirati aminske skupine, predvsem N-končnega metionina, v rekombinantnem proteinu Nano-tag(9)-rBd. Formiliranje aminskih skupin proteina smo poskušali izvesti s specifičnim reagentom za formiliranje aminov in alkoholov; 2,2,2-trifluoroetilformatom (TFEF) [36]. Pri formiliranju aminokislinskih derivatov z reagentom TFEF smo najprej postopali po protokolu Davida R. Hilla in sodelavcev, ki so reakcije izvajali v raztopinah z uporabo različnih topil. Predhodno smo ocenili topnost modelnega proteina (BSA) v različnih organskih topilih. Izkazalo se je, da je BSA najbolje topen v THF. Reakcijo smo izvajali tako v organskem topilu THF kot tudi v vodnem mediju z enim in petimi ekvivalenti reagenta preko noči pri sobni temperaturi. Na tak način smo skušali ustvariti prebitek reagenta ter zagotoviti čim bolj učinkovit potek formiliranja ob zavedanju neselektivnosti reakcije [36]. Potek reakcije in posledično sposobnost vezave formiliranega rekombinantnega proteina na streptavidin smo preverili z metodo točkovnega nanosa (slika 18). 53

65 Slika 18: Preverjanje sposobnosti vezave SA-HRP na Nano-tag(9)-rBd s točkovnim nanosom po formiliranju z reagentom TFEF v raztopini. Pri točkovnem nanosu (slika 18) je vidna zgolj lisa pozitivne kontrole, kar pomeni ustrezno izvedbo detekcije. Pri ostalih vzorcih nismo zaznali lis na nitrocelulozni membrani, zato smo sklepali, da reakcija formiliranja ni potekla. Nato smo po lastni ideji poskusili formiliranje z reagentom TFEF izvesti še na kromatografski koloni za IMAC. Reakcijo smo izvajali v stekleni koloni, napolnjeni z nosilcem HIS-Select Nickel Affinity Gel. V alkalnem mediju (0,1 M karbonatni pufer ph 10) smo nanesli vzorec rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd ter na tak način vezali protein na nosilec. S spiranjem z alkalnim pufrom natrijevega karbonata smo obenem zagotovili, da je bilo pred dodatkom reagenta čim večje število aminskih skupin deprotoniranih. Z niţjo koncentracijo (10 mm) karbonatnega pufra ph 10 smo nato sprali soli ter kasneje dodali DMF, organsko topilo za reagent TFEF. Reakcijo formiliranja smo izvajali s spuščanjem reagenta TFEF, raztopljenega v topilu DMF, skozi kolono ter z obstojem slednjega v koloni preko noči pri 4 C. DMF smo nato sprali z alkalnim pufrom natrijevega karbonata in zatem še s pufrom PBS ter rekombinantni protein eluirali z kompetitivnim ligandom 250 mm imidazolom v PBS. Zbranim eluatom (po 200 µl) smo spektrofotometrično ocenili koncentracijo proteina Nanotag(9)-rBd. 54

66 Tabela XIV: Koncentracija proteina Nano-tag(9)-rBd v posameznih frakcijah po formiliranju z TFEF na kromatografski koloni IMAC. Eluat A 280 c [mg/ml] E1 0 0 E2 0,038 0,050 E3 1,135 1,495 E4 0,488 0,643 E5 0,196 0,258 E6 0,096 0,126 E7 0,046 0,061 E8 0,019 0,025 E9 0,028 0,037 Zdruţili smo eluate od E3 do E6 ter ponovno spektrofotometrično ocenili koncentracijo rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd. Tabela XV: Koncentracija proteina Nano-tag(9)-rBd po zdruţitvi eluatov. Absorbanca c [mg/ml] 0,417 0,550 Sledilo je preverjanje sposobnosti vezave SA-HRP na Nano-tag(9)-rBd z encimsko-imunskim testom (ELISA 3), kjer smo na mikrotitrsko ploščico vezali rekombinantni protein Nanotag(9)-rBd po formiliranju s specifičnim reagentom TFEF v vdolbinico A in B ter Nanotag(9)-rBd pred formiliranjem (vdolbinica C). Detekcijo smo v vseh vdolbinicah izvajali s konjugatom SA-HRP (na sliki 19 ni označeno). 55

67 Abosrbanca (450 nm) 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Slika 19: Preverjanje sposobnosti vezave Nano-tag(9)-rBd na SA-HRP z encimsko-imunskim testom (ELISA 3). Opazili smo visok odziv pri pozitivni kontroli (biotiniliran leptin, vdolbinica E) ter neobarvano negativno kontrolo (vdolbinica D), kar kaţe na ustreznost izvedbe testa. Zaznali smo, da je prišlo tudi do znatnega odziva pri obeh redčitvah formiliranega rekombinantnega proteina Nano-tag(9) (vdolbinici A in B), medtem ko neformiliran Nano-tag(9) (vdolbinica C; vzorec pred reakcijo) ni dal signala. Formiliranje in encimsko-imunski test sta potrdila tezo, da je za vezavo na streptavidin nujno potrebna N-končna formilna skupina na metioninu Nano-tag(9). Sledilo je dodatno preverjanje sposobnosti vezave na streptavidin z encimsko-imunskim testom (ELISA 4). Dodali smo raztopine izoliranega rekombinantnega proteina pred formiliranjem in vzorce po formiliranju ter detektirali s SA-HRP ali SA-HRP v kombinaciji z biotinom ali protitelesi mab-anti-m13-hrp. 56

68 Absorbanca (450 nm) 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Slika 20: Rezultati preverjanja funkcionalnosti Nano-tag(9)-rBd z encimsko-imunskim testom (ELISA 4). Visok odziv smo opazili pri pozitivni kontroli (SpA/0/mAb-anti-M13-HRP), kar potrdi ustreznost izvedbe testa. V prvih dveh vdolbinicah smo preverjali sposobnost vezave afinitetnega podaljška Nano-tag(9) po formiliranju na streptavidin; celoten kompleks smo skušali detektirati s protitelesom usmerjenim proti domeni B. Signala nismo zaznali, saj predvidevamo, da s pogoji formiliranja rekombinantnega proteina najverjetneje povzročimo denaturacijo proteina, zaradi česar se izgubi sposobnost vezave kompleksa na regijo Fc. Vdolbinica z nanosom BSA/Nano9-rBd(po f.)/mab-anti-m13-hrp je sluţila kot negativna kontrola. V vdolbinicah s SA/Nano9-rBd(pred f.)/mab-anti-m13-hrp nismo pričakovali signala, saj rekombinantni protein ni formiliran in zaradi tega nesposoben vezave na streptavidin. Zopet je vdolbinica BSA/Nano9-rBd(pred f.)/mab-anti-m13-hrp sluţila kot negativna kontrola. Pri vdolbinici Nano9-rBd(pred f.)/0/mab-anti-m13-hrp smo zaznali visok signal, kar je posledica sposobnosti vezave protitelesa mab-anti-m13-hrp na domeno B v nativnem rekombinantnem proteinu. Signal v vdolbinici AntiHis/Nano9-rBd (po f.)/sa- HRP nam pa pove veliko več. V vdolbinico smo nanesli protitelesa Anti His in dodali Nanotag(9)-rBd po formiliranju z reagentom TFEF na kromatografski koloni IMAC ter ga detektirali s konjugatom SA-HRP. S histidinskim podaljškom se je protein vezal na 57

69 protitelesa Anti His ter celoten kompleks preko Nano-tag(9) detektirali s streptavidinom. To potrjuje tezo, da afinitetni podaljšek Nano-tag(9) nujno potrebuje formilno skupino na N- končnem metioninu za vezavo na streptavidin ter da je vezava Nano-tag(9) po formiliranju na uspešna. Vdolbinica BSA/Nano9-rBd(po f.)/sa-hrp je zopet sluţila kot negativna kontrola. V vdolbinicah AntiHis/Nano9-rBd(pred f.)/sa-hrp ni bilo opaznega signala, kar potrjuje tezo, da izraţen rekombinanten protein ni formiliran na končnem metioninu ter s tem nesposoben vezave na streptavidin. Vdolbinica BSA/Nano9-rBd(pred f.)/sa-hrp je sluţila kot negativna kontrola. V vdolbinici Fc/Nano9-rBd(po f.)/sa-hrp ni bilo opaznega signala. Predvidevamo, da je s pogoji formiliranja prišlo do denaturacije rekombinantnega proteina ter s tem do nesposobnosti vezave na Fc regijo. V vdolbinici Fc/Nano9-rBd(pred f.)/sa-hrp prav tako ni prišlo do signala. Vzrok je v nesposobnosti vezave rekombinantnega proteina na streptavidin, kljub temu, da se protein veţe na Fc regijo protiteles. Po vseh izvedenih encimsko-imunskih preskusih sposobnosti vezave smo prišli do zaključka, da Nano-tag(9)-rBd za vezavo na streptavidin nujno potrebuje N-končno formilno skupino na končnem metioninu. Z reagentom TFEF nam je uspelo formiliranje N-končnega metionina, s čimer smo potrdili vzrok neuspešne vezave afinitetnega podaljška Nano-tag(9) na streptavidin. S točkovnim nanosom nam ni uspelo dokazati sposobnosti vezave Nano-tag(9)- rbd na streptavidin (slika 18). Predvidevamo, da problem predstavlja organsko topilo DMF, ki močno reagira z nitrocelulozno membrano. Problem, ki se lahko pojavi pri nadaljnjem delu, je agresivna metoda formiliranja, ki lahko vpliva na strukturo izraţenega rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd ter dostopnost afinitetnega podaljška. Vsekakor bi bile potrebne dodatne raziskave na področju formiliranja (spreminjanje eksperimentalnih pogojev) ali celo encimsko vodena formilacija, ki bi bila regiospecifična. 58

70 6. SKLEP S ciljem vzpostavitve modelnega testa za detekcijo ligandov streptavidina s pomočjo tehnologije FRET je bil namen magistrske naloge načrtovati ter pripraviti modelni fuzijski protein, zgrajen iz nosilnega proteina (domena B stafilokoknega proteina A) in ustreznega peptidnega liganda streptavidina (t.i. Nano-tag(9)). Z ustreznim načrtovanjem genskega konstrukta smo na N-konec domene B stafilokoknega proteina A uvedli znano aminokislinsko zaporedje afinitetnega podaljška Nano-tag(9) in omenjen konstrukt vstavili v ekspresijski vektor pet-28. Načrtovani fuzijski protein smo brez teţav izrazili v ekspresijskem sistemu Escherichia coli ter prečistili s kovinsko-kelatno kromatografijo in sledečo gelsko filtracijo. Z določitvijo N-končnih petih aminokislin smo potrdili, da se je izrazil predhodno zasnovani rekombinantni fuzijski Nano-tag(9)-rBd. Z encimsko-imunskimi testi (ELISA), točkovnimi nanosi ter prenosom western nismo mogli potrditi pričakovane vezave afinitetnega podaljška Nano-tag(9), izraţenega na N-koncu rekombinantnega proteina Nano-tag(9)-rBd, na konjugat SA-HRP. Sklepali smo, da je najverjetnejši vzrok za to odsotnost formilne skupine na N-končnem metioninu, zaradi česar smo izraţeni rekombinantni protein skušali kemijsko modificirati tako, da bi formilirali čim več aminskih skupin, vključno z N-končnim metioninom. Formiliranje smo skušali izvesti z reagentom 2,2,2-trifluoroetilformat (TFEF) na dva načina, v raztopini in na kromatografskem nosilcu, kar nam je na podlagi dobljenih rezultatov preverjanja vezave Nano-tag(9)-rBd na streptavidin vsaj deloma tudi uspelo, vseeno pa bi bilo vezavo potrebno potrditi še z dodatnimi testi in postopek formiliranja ustrezno optimizirati, po moţnosti tako, da bi formiliranje prednostno potekalo le na N-končni aminski skupini, večina ostalih pa bi ostala nezasedenih za potrebe dodatnega označevanja fuzijskega proteina Nano-tag(9)-rBd s fluorescenčnim barvilom TAMRA. Morda bi bilo smiselna in zanimiva tudi encimsko vodena formilacija, ki bi bila regiospecifična. 59

71 7. VIRI IN LITERATURA [1] Clarke J., Regan L., Protein engineering and design: from first principles to new technologies., Curr. Opin. Struct. Biol., 2010; 20: [2] Turanli-yildiz B., Alkim C., and Cakar Z.P., Protein Engineering Methods and Applications, v Protein Engineering, 1., 2012, dostopno na svetovnem spletu: [ ]. [3] Chen Z., Protein Design, v knjigi Encyclopedia of Chemical Processing, 1., Taylor & Francis, 2006, [4] Sawyer N., Speltz E.B., and Regan L., NextGen protein design., Biochem. Soc. Trans., 2013; 41: [5] Rubingh D.N., Grayling R.A., Protein engineering, v knjigi Encyclopedia of Life Support Systems, 3., EOLSS, [6] Schmidt R.S., Fusion Protein Technologies for Biopharmaceuticals: Applications and Challenges", John Wiley & Sons, New Jersey, 2013, [7] Zhang J., Yun J., Shang Z., Zhang X., Pan B., Design and optimization of a linker for fusion protein construction, Prog. Nat. Sci., 2009; 19: [8] Costa S., Almeida A., Castro A., Domingues L., Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system., Front. Microbiol., 2014, 5: [9] Edwards, Arrowsmith, Savchenko, Yee, Yamazaki, Producing proteins, v knjigi Chasman D., Protein Structure: Determination, Analysis, and Applications for Drug Discovery, CRC Press, 2003: [10] Terpe K., Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003; 60: [11] Schmidt T.G.M., Koepke J., Frank R., Skerra A., Molecular interaction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target, streptavidin., J. Mol. Biol., 1996; 255: [12] Skerra A., Schmidt T.G.M., Applications of a peptide ligand for streptavidin: the Strep-tag., Biomol. Eng., 1999; 16: [13] Lamla T., Erdmann V.A., The Nano-tag, a streptavidin-binding peptide for the purification and detection of recombinant proteins., Protein Expr. Purif., 2004; 33: [14] Hermanson G.T., Bioconjugate Techniques, 3., Academic Press,London, 2013:

72 [15] Dundas C.M., Demonte D.,Park S., Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2013; 97: [16] Diamandis E.P., Christopoulos T.K., The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology., Clin. Chem., 1991; 37: [17] Hermanson G.T.,Bioconjugate Techniques, 2., Academic Press,London, 2010: [18] Heftmann E., Chromatography: Fundamentals and applications of chromatography and related differential migration methods - Part A: Fundamentals and techniques., Elsevier, Amsterdam, 2004: [19] Held P., An Introduction to Fluorescence Resonance Energy Transfer ( FRET ) Technology and its Application in Bioscience, 2012, dostopno na svetovnem spletu: [ ]. [20] Herman B., Gordon G.W., Berry G., Liang X.H., Levine B., Quantitative Fluorescence Resonance Energy Transfer Measurements Using Fluorescence Microscopy, 1998, 74: [21] Song Y., Madahar V., Liao J., Development of FRET assay into quantitative and highthroughput screening technology platforms for protein-protein interactions., Ann. Biomed. Eng., 2011; 39: [22] Medintz I., Hildebrandt N., FRET - Förster Resonance Energy Transfer: From Theory to Applications, John Wiley & Sons, Weinheim, 2013: [23] TriLink, Quenchers. Dostopno na svetovnem spletu: [ ]. [24] TriLink Quenchers. Dostopno na svetovnem spletu: [ ]. [25] Arkin R.M., Glicksman A.M., Fu H., Havel J.J., Du Y., Inhibition of Protein-Protein Interactions: Non-Cellular Assay Formats. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, 01-Oct [26] Radin K., Vrednotenje sposobnosti vezave peptidov, izoliranih iz bakteriofagnih peptidno predstavitvenih, na polistiren. Ljubljana, [27] Sigma-Aldrich, GenElute, Plasmid Miniprep Kit, dostopno na svetovnem spletu: [ ]. [28] Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T., Molecular cloning, 4., New York,

73 [29] QIAEX, Handbook For DNA extraction from agarose and polyacrylamide gels and for desalting Sample & Assay Technologies QIAGEN Sample and Assay Technologies, dostopno na svetovnem spletu: 76eb31a29801 [ ]. [30] Sanger method of DNA sequencing, 3D animation with narration :: DNA Learning Center. Dostopno na svetovnem spletu: [ ]. [31] Protein Calculator. Dostopno na svetovnem spletu: [ ]. [32] ExPASy - ProtParam tool. Dostopno na svetovnem spletu: [ ]. [33] Thermo scientific, Coomassie Plus TM ( Bradford ) Assay Kit. [34] Perbandt M., Bruns O., Vallazza M., Lamla T., Betzel C., Erdmann V.A., High resolution structure of streptavidin in complex with a novel high affinity peptide tag mimicking the biotin binding motif., Proteins, 2007; 67: [35] I-TASSER server for protein structure and function prediction. Dostopno na svetovnem spletu: [ ]. [36] Hill D.R., Hsiao C.N., Kurukulasuriya R., Wittenberger S.J., 2,2,2-Trifluoroethyl Formate - A Versatile and Selective Reagent for the Formylation of Alcohols, Amines, and N-Hydroxylamines, Organic letters, 2002, 4:

74 8. PRILOGE Priloga 1: Genska karta izhodnega plazmida pet-28. Plazmid pet-28 je 5368 bp velik vektor, ki vsebuje: T7 promotor, kodirajoče zaporedje za His Tag, kodirajoče zaporedje za T7 Tag, gen lac I (gen za lac represor), gen za aminoglikozid 3'-fosfotransferazo II (gen za kanamicinsko rezistenco) in med ostalimi tudi restrikcijski mesti za XhoI in NcoI znotraj multiplega mesta za kloniranje (MCS). 63

75 Priloga 2: Nukleotidno zaporedje izhodnega plazmida pet-28/b_insert T7 promotor lac operator...atcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggat AACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGTTATAT CCGCGGGCGGTGGAAGTGCTGATAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAA ATTTTACATTTACCTAACTTAAATGAAGAGCAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGA TGACCCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCACAAGCAC CAAAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAA GCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACG GGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT... Nukleotidno zaporedje izhodnega plazmida pet-28/b_insert. S puščico je označeno zaporedje promotorja T7, z modro obarvanimi črkami je predstavljeno zaporedje operatorja lac. Z oranţno barvo pa je predstavljeno zaporedje za ribosomsko vezavno mesto (ang. ribosomal binding side). Z rumeno barvo je označeno restrikcijsko mesto za NcoI, z vijolično barvo je označeno dodatno vnešeno restrikcijsko mesto za SacII, s sivo pa restrikcijsko mesto XhoI. S poudarjenim zelenim tiskom je označeno nukleotidno zaporedje, ki kodira B-SpA, s povečanimi črkami sta poudarjena začetni (atg) in končni (tga) kodon. Rdeče je zapisano kodirajoče zaporedje heksahistidinskega podaljška. Podčrtani sta zaporedji, kamor se prilegata začetna oligonukleotida T7 in R-XhoI [26]. 64

76 Priloga 3: Prikaz rezultatov določitve N-končnega aminokislinskega zaporedja proteina Nano-tag(9)-rBd z Edmanovo degradacijo. Desno spodaj je podan kromatogram aminokislinskih standardov. 65