MOLEKULSKI MARKERJI ZA PEKOČ OKUS PRI PAPRIKI IN NJIHOVA UPORABNOST PRI ŽLAHTNJENJU

Transcription

1 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO Gašper SMRDELJ MOLEKULSKI MARKERJI ZA PEKOČ OKUS PRI PAPRIKI IN NJIHOVA UPORABNOST PRI ŽLAHTNJENJU DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja Ljubljana, 2017

2 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO Gašper SMRDELJ MOLEKULSKI MARKERJI ZA PEKOČ OKUS PRI PAPRIKI IN NJIHOVA UPORABNOST PRI ŽLAHTNJENJU DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja MOLECULAR MARKERS FOR THE SPICY TASTE IN PEPPER AND THEIR USE IN THE BREEDING B. SC. THESIS Academic Study Programmes Ljubljana, 2017

3 Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študija Kmetijstvo agronomija 1. stopnja. Delo je bilo opravljeno na Katedri za genetiko, biotehnologijo, statistiko in žlahtnjenje rastlin. Študijska komisija Oddelka za agronomijo je za mentorja diplomskega dela imenovala prof. dr. Jerneja Jakše. Komisija za oceno in zagovor: Predsednik: prof. dr. Metka Hudina Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: prof. dr. Jernej Jakše Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: prof. dr. Nataša Štajner Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Datum zagovora: II

4 KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1 DK UDK : :577.2 (043.2) KG AV SA kapsaicin / markerji / genom / paprika / sekundarni metaboliti / žlahtnenje rastlin SMRDELJ, Gašper JAKŠE, Jernej (mentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA LI 2017 IN TD OP IJ JI AI Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Univerzitetni študijski program prve stopnje Kmetijstvo - agronomija MOLEKULSKI MARKERJI ZA PEKOČ OKUS PRI PAPRIKI IN NJIHOVA UPORABNOST PRI ŽLAHTNJENJU Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja) VI, 16 str., 1 pregl., 8 sl., 33 vir. sl sl/en Paprika kot rastlina s pekočim okusom je po vsem svetu razširjena in pomembna zelenjadnica. Njen pekoči okus povzroča snov kapsaicin iz skupine alkaloidov, kateri ima veliko že raziskanih in še neraziskanih delovanj na človeka in je edinstven za rod Capsicum. Nedavno posekvenciran genom paprike omogoča nadaljnje raziskave v rodu paprik in njenih sorodnic. Uporaba genetskih orodij veliko prispeva h kvalitetnemu žlahtnjenju novih sort paprik. Z uporabo DNK markerjev lahko določimo oz. sledimo kapsinoidni biosintezni sposobnost rastline. Preverjali so uporabnost razvitih SCAR markerjev v žlahtniteljskem programu paprike in nukleotidno zaporedja regije, kjer je prisotna delecija v ne-pekoči papriki, uporabili za filogenetske študije. Razviti genetski markerji imajo neposredno uporabno vrednost za razločevanje pekočih in ne-pekočih paprik v stadiju sadik v žlahtniteljskih programih. III

5 ND Du1 DC UDC : :577.2 (043.2) CX AU AA KEY WORDS DOCUMENTATION capsaicin / markers /genome sequence/ pepper / secondary metabolites / plant breeding SMRDELJ, Gašper JAKŠE, Jernej (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB PY 2017 TI DT NO LA Al AB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Agronomy, Academic Study Programme in Agriculture - Agronomy MOLECULAR MARKERS FOR THE SPICY TASTE IN PEPPER AND THEIR USE IN THE BREEDING B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes) VI, 16 p., 1 tab., 8 fig.,33 ref. sl sl/en Pepper as a plant with a spicy taste is an important worldwide vegetable. Its spicy taste is caused by a substance called capsaicin, from the group of chemicals named alkaloids, which has a lot of documented and undocumented effects on humans and is unique to Capsicum genus. Recently sequenced pepper genome enables further research in the genus of peppers and its relatives. The use of genetic tools makes a significant contribution to the quality of breeding new varieties of peppers. By using the DNA markers we can determine capsinoid biosynthetic ability of plants. Researchers have discovered the usefulness of SCAR markers for pepper breeding programs and used nucleotide region of sequence hrbouring a deletion present in mild peppers for phylogenetic studies. Developed genetic markers have direct practical value in breeding programs for distinguishing spicy and non-spicy peppers at the seedling stage. IV

6 KAZALO VSEBINE Str. KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA... III KEY WORDS DOCUMENTATION... IV KAZALO VSEBINE... V KAZALO PREGLEDNIC... VI KAZALO SLIK... VI 1 UVOD PAPRIKA KAPSAICINOIDI GENOM PAPRIKE MARKERJI PRI ŽLAHTNENJU PAPRIKE SCAR MARKERJI, KI TEMELJIJO NA CS ZAPOREDJU CS GEN NE-PEKOČE PAPRIKE IMA 2529 BP DELECIJO UPORABA MARKERJEV PRI GOJENJU NOVE SORTE SVEŽE PAPRIKE, KI VSEBUJE KAPSINOIDE Križanje sort Razvoj novih kultivarjev SKLEPI VIRI V

7 KAZALO PREGLEDNIC Str. Preglednica 1: Statistika za genom in anotiacije genov pekoče paprike (Seungill in sod., 2014) 3 KAZALO SLIK Str. Slika 1: Grafična predstavitev genoma in kromosomov paprike. (Seungill in sod., 2014) 4 Slika 2: Analiza ekspanzije genoma paprike glede na Genom paradižnika. (Seungill in sod., 2014) 4 Slika 3: Prikaz povezanosti zaporedja CS s pekočim fenotipom. (Choong in sod., 2004) 6 Slika 4: Northern blot analiza gena CS v placenti različnih paprik. (Choong in sod., 2004) 6 Slika 5: Primerjava pomnoževanja SCAR markerjev pri pekočih in ne pekočih paprikah. (Choong in sod., 2004) 8 Slika 6: Za oceno uspešnosti prenosa SCAR markerjev tudi na druge genotipe so uporabili šest linij paprik. (Choong in sod., 2004) 8 Slika 7 : Skupno dedovanje biosinteze kapsinoida na podlagi analize P-AMT in Pun1 genotipov (Yoshiyuki in sod., 2014) 11 Slika 8: Rodovnik sorte ʹMaru Saladʹ, ki so jo požlahtnili s pomočjo molekulskih DNA markerjev (Yoshiyuki in sod., 2014) 11 VI

8 1 UVOD Paprike izvirajo iz Srednje in Južne Amerike, in so sedaj pomembna zelenjadnica, ki jo gojijo po vsem svetu. Uživa se jih kot svežo zelenjavo in predela v prah, omake in salse. Pekoč okus je edinstvena lastnost rastlin iz rodu Capsicum in ena izmed glavnih lastnosti za gojitelje paprik. Eden od ciljev žlahtniteljskih programov paprike je nadzor pekočega okusa ploda, da bi izpolnili različne potrebe predelovalne industrije in samih potrošnikov (Yoon in sod., 1992). Skoraj vse divje pekoče paprike so pekoče, medtem ko so sladke paprike rezultat udomačitve (Andrews, 1995). Večina paprik sodi v vrsto C. annuum, ki je najbolj gojena vrsta. Za vzgojo paprike, je natančna izbira različno pekočih linij pomembna in tudi zaželena. 2 PAPRIKA Paprika je član družine Solanaceae oz. razhudnikovk. To je diploidna, fakultativna, samoprašna rastlinska vrsta in je tesno povezana s krompirjem, paradižnikom, jajčevci, tobakom in petunijami, ki spadajo v isto družino. Številne rastline družine razhudnikovk imajo enako število kromosomov (n = 12) vendar se bistveno razlikujejo v velikosti genoma. Paprika je ena izmed najstarejših udomačenih rastlin na zahodni polobli (Aguilar- Meléndez in sod., 2009), je najbolj razširjena začimba na svetu in je glavna sestavina v večini svetovnih kuhinj (Bosland in sod., 2012). Paprika ima širok spekter uporabe, vključno v farmacevtiki, industriji naravnih barvil in kozmetiki, kot okrasna rastlina in kot aktivna sestavina v večini obrambnih repelentov. Paprika ponuja številne bistvene vitamine, minerale in hranilne snovi, ki imajo velik pomen za zdravje človeka (Marín in sod., 2004). V letu 2011, je 20 največjih držav, ki proizvajajo papriko pridelalo 33,3 milijonov ton pekoče paprike, zasajene na 3,8 M ha zemljišč (statistika Združenih narodov za prehrano in kmetijstvo (FAO), glej URL). V zadnjem desetletju se je svetovna proizvodnja paprike povečala kar za 40 %. 2.1 KAPSAICINOIDI Do pekočega okusa paprike pride zaradi kopičenja kapsaicinoidov, skupine alkaloidov, ki so edinstveni za rod Capsicum. Kapsaicin, dihidrokapsaicin in nordihidrokapsaicin predstavljajo primarne kapsaicinoide, ki se proizvajajo izključno v žlezah na placenti ploda. Organoleptični občutek toplote nastane, ko se kapsaicin veže na prehodne receptorje sesalcev. Številni encimi, ki sodelujejo v biosintezi kapsaicina niso dobro opisani, in regulacija poti ni povsem jasna. Z več kot 22 kapsaicinoidov izoliranih iz pekoče paprike, ta rod zagotavlja odličen primer za raziskovanje razvoja sekundarnih metabolitov v rastlinah (Bosland in sod., 2012). Kapsaicinoidi so v naravi pokazali, da imajo protiglivične in antibakterijske lastnosti, da delujejo kot svarilo za živali plenilcev ob zaužitju in imajo značilne lastnosti, ki pomagajo ptičem pri širjenju semen. Kapsaicinoidi imajo številne koristi za zdravje ljudi: so učinkoviti pri zaviranju rasti različnih oblik raka, (Surh, 2002; Ito in sod., 2004) so analgetik za artritis in druge bolečine (Fraenkel in sod., 2004), zmanjšujejo apetit in spodbujajo zmanjšanje teže (Lejeune in sod., 2003; Smeets in sod., 2005). Presenetljivo je, da je popolno razumevanje biosintetske poti kapsaicina na 1

9 molekularnem nivoju pomanjkljivo, glede na gospodarski in kulturni pomen kapsaicinoidov. 2.2 GENOM PAPRIKE Nedavno so določili genomsko zaporedje visoke kvalitete za pekočo papriko ʹC. annuum cv. CM334ʹ (ʹCriollo de Morelos 334ʹ), ki je domača sorta iz mehiške države Morelos. Ta sorta je stalno prikazovala visoko stopnjo odpornosti na različne patogene, vključno z glivo Phytophthora capsici, virusom pegavosti paprike in koreninske nematode. Ta domača sorta je bila v veliki meri uporabljena v raziskavah pekoče paprike in pri žlahtnjenju novih kultivarjev. Pridobili so tudi nukleotidne podatke dveh gojenih paprik in za divjo vrsto C. chinense. Primerjalna genomika članov družine Solanaceae, ki vključuje pekočo papriko, predstavi evolucijski pogled v širitev genoma, poreklo pekočega okusa, ločenega procesa zorenja in odpornosti proti boleznim pekoče paprike. Ta visoko kakovosten referenčni genom paprike bo služil kot platforma za izboljšanje hortikulturnih, hranilnih in zdravilnih vrednosti Capsicum vrst (Seungill in sod., 2014). Ta študija predvideva, da je lastnost pekočega okusa paprike nastala z razvojem novih genov, zaradi neenakega podvajanja obstoječih genov in zaradi sprememb v izražanju genov v plodu po speciaciji oz. nastanku novih vrst. Preglednica 1: Statistika za genom in anotiacije genov pekoče paprike (Kim in sod., 2014) Parametri Vrednosti Število skafoldov 37,989 Skupna dolžina skafoldov 3.06 Gb Skafoldi umeščeni na kromosome 2.63 Gb (86.0%) N50 vrednost skafoldov 2.47 Mb Najdaljši (najkrajši) skafold 18.6 Mb (264 bp) Število kontigov 337,328 Skupna dolžina kontigov 2.96 Gb N50 vrednost kontigov 30.0 kb (24,618th) Najdaljši (najkrajši) kontig kb (71 bp) Vsebnost GC 35.03% Število genov 34,903 Average/total coding sequence length 1,009.9/35.2 Mb Povprečna/skupna dolžina kodirajočih sekvenc Povprečna dolžina eksonov/intronov bp/541.6 bp Skupna dolžina transpozonov 2.34 Gb (76.4%) Skupaj so generirali Gb surovih podatkov zaporedij iz celotnega genoma iz C. annuum ʹcv. CM334ʹ. Uporabili so Illumina tehnologijo določevanja nukleotidnih zaporedij genomskih knjižnic z inserti velikosti od 180 bp do 20 kb. Na podlagi analize 19 bp dolgih DNA zaporedij (K-mer analiza) so ocenili velikost genoma paprike na 3,48 Gb. 2

10 Po filtraciji podatkov in sestavljanju so dobili 3,06 Gb velik genom v 37,989 skafoldih in 90 % dela genoma je bilo predstavljenih s samo imi skafoldi (Preglednica 1). Ponovno so sekvencirali dva kultivarja paprike ('Perrenial' in 'Dempsey') in de-novo sekvencirali tudi divjo vrsto (C. chinense ʹPI159236ʹ, v nadaljnjem besedilu: C. chinense), da bi zagotovili celovit pregled genetske variabilnosti in razlike v strukturi genoma med različnimi sortami paprik. Divergentne sekvence so zelo razpršene vzdolž kromosomov paprike. Število malo pokritih regij (190 v 500 kb premikajočih oknih zaporedja), ki niso bili usklajeni med C. annuum in C. chinense, kažejo genomske razlike v teh dveh vrstah (Slika 1). Genom pekoče paprike deli veliko ohranjenih regij z genomom paradižnika, njegovemu sorodniku znotraj družine Solanaceae. Vendar pa je genom paprike približno štirikrat večji od genoma paradižnika, zaradi večjega kopičenja ponavljajočih se sekvenc v obeh, tako heterokromatinskih kot evkromatinskih regijah genoma (Slika 2). Najpogostejša ponavljanja genomu pekoče paprike so bili LTR retrotranspozoni, kot v mnogih drugih rastlinskih genomih (Feschotte in sod., 2002). Slika 1: Grafična predstavitev genoma in kromosomov paprike. Od leve proti desni: gostota ujemanja regij, gostota genov, obseg ponovitev in gostota polimorfizmov enega nukleotida (SNP). Gostota ujemanja regij, je predstavljena glede na referenčni genom v C. chinense, C. annum cv. 'Dempsey' in C. annum cv. 'Perennial' (od leve proti desni) za 500 kb okna (Seungill in sod., 2014). 3

11 Slika 2: Analiza ekspanzije genoma paprike glede na genom paradižnika. (A) Krožni diagram, ki prikazuje genetsko kolinearnost med pekočo papriko in paradižnikom. Kromosomi paprike in pripadajoči kromosomi paradižnika so predstavljeni z rdečimi in modrimi črtami. Linije povezujejo pozicijo ortolognih genskih sklopov, z barvno črto, ki predstavlja vsak kromosomski niz. (B) Zgoraj, linearna primerjava kromosoma 2 v pekoči papriki (zgornji del) in paradižnik (nižji del). Pozicije ortolognih genskih nizov so označene s črtami, ki povezujejo dva dela. Modra in beli bloki kažejo ponavljajoče dele in genske regije. Spodaj, primerjave povečave regije pekoče paprike in paradižnika. (Seungill in sod., 2014). 3 MARKERJI PRI ŽLAHTNENJU PAPRIKE Pekoč okus je odvisen od enega samega prevladujočega gena (Andrews, 1995), kot smo že omenili v predhodnem tekstu. Molekularne genetske karte paprike so razvili: Lefebvre in sod., 1995; Livingstone in sod., 1999; Kang in sod., 2001 ter Blum in sod., Lokus C, gen ki določa pekoč okus, se nahaja na kromosomu 2 (Blum in sod., 2002; Lefebvre in sod., 2002). Prav tako so bili nekateri geni za biosintezo kapsaicina že izolirani. Curry in sod., 1999 so izolirali gene, ki kodirajo domnevno aminotransferazo (pamt) in sintazo 3- keto-acil-acp (KAS). Kim in sod., 2001, so izolirali 39 cdna iz placent plodov čilijev z metodo subtraktivne cdna knjižnice (SSH, angl. suppression subtractive hybridization). Opisali so tri gene, ki kodirajo encime biosinteze kapsaicina: SB2-66, določena domnevno kapsaicin - sintazo (CS), SB2-149, aminotransferazo in SB1-58, A-sintaza 3-keto-acil- ACP. Analizirali so segregacijo SB2-66 in ugotovili, da je tesno povezana z lokusom C. Razvili so tudi pet SCAR markerjev, ki temeljijo na CS zaporedju in testirali njihovo uporabnost pri žlahtnjenju oz. kot marker za pekoči okus. 3.1 SCAR MARKERJI, KI TEMELJIJO NA CS ZAPOREDJU Določitev segregacije lastnosti pekočega okusa F2 populacije iz križanja C. annuum ʹCM334ʹ in C. annuum ʹECW123Rʹ so izvedli v opisanem poskusu. Rastline so gojili v rastlinjaku od leta 2002 do leta Plodove paprik 121-ih rastlin so pobrali v primerni 4

12 zrelosti in opravili test degustacije (2002) in analizo s HPLC metodo (v letih 2002 in 2003) za kvalitativno in kvantitativno določanje vsebnosti kapsaicina. Preučili so medsebojno dedovanje lokusa CS (na osnovi nukleotidnih zaporedij) in lokusa C za potrditev povezave lokalizacije CS z lokusom C, z F2 populacijo iz križanja z nepekočim C. annuum, ʹECW123Rʹ in rahlo pekočim C. annuum, ʹCM334ʹ. HPLC analiza kapsaicinoidov od 121-ih F2 posameznikov je pokazala, da je razmerje med pekočimi, in ne-pekočimi posamezniki 3: 1 (χ2 = 0,03). Tako se je lastnost pekočega okusa obnašala kot tipična dominantna monogenska lastnost. Pregledali so genomsko DNA populacije F2 in staršev s PCR z začetnimi oligonukleotidi CSF1 in CSR4. PCR produkt je bil en sam fragment dolg približno 1,6 kb, kot je bilo pričakovano iz CS zaporedja. Fragmenti so se jasno ločili v vseh testiranih posameznikih (Slika 3). Gen CS je bil izražen različno v tkivu placente (Kim in sod., 2001) pri pekoči in ne-pekoči papriki (Slika 4). Tako genetsko kartiranje in specifična ekspresija v placenti pekoče paprike potrjuje ugotovitev, da gen CS ustreza lokusu C. Slika 3: Prikaz povezanosti zaporedja CS s pekočim fenotipom. Uporabljen par začetnih oligonukleotidov je CSF1 in CSR4. Elektroforezo produktov so izvedli na 0,8 % agaroznem gelu. Številke linij so številke F 2 paprik. C je pekoča paprika ʹCM334ʹ in E nepekoča paprika ʹECW123Rʹ, ki sta bili uporabljeni v križanju kot starševski liniji. Pekoč fenotip je označen kot "P" in ne pekoč kot "N". Na sliki se lepo vidi povezanost fragmenta DNA s pekočim fenotipom (Choong in sod., 2004). 5

13 Slika 4: Northern blot analiza gena CS v placenti različnih paprik. Linija 1, Capsicum annuum, ʹHaehwaIIIʹ; linija 2, C. annuum, ECW; linija 3, C. chinense, ʹHabaneroʹ; linija 4, C. annuum, ʹCM334ʹ (Choong in sod., 2004). 3.2 CS GEN NE-PEKOČE PAPRIKE IMA 2529 BP DELECIJO Nadalje so bili PCR začetni oligonukleotidi izdelani iz celotne dolžine cdna zaporedja CS (SB2-66) za primerjavo istih genomskih regij pekoče paprike ʹHabaneroʹ z ne pekočo papriko ʹHaehwaIIIʹ. Slika 5 prikazuje PCR produkte, pridobljene s šestimi različnimi kombinacijami začetnih oligonukleotidov pri vzorcih pekočih in ne-pekočih paprik. Struktura CS gena in mesta začetnih oligonukleotidov so prikazani na Sliki 5. PCR pomnoževanje z začetnimi oligonukeleotidi CSF1 in CSR4, in CSF1 in CSR2 je ustvarilo in 434 bp dolga produkta pomnoževanja pri pekoči papriki, toda nobenega fragmenta pri ne-pekoči papriki. Na drugi strani pa so pri pomnoževanju z začetnima oligonukleotidoma CSF3 in CSR4 pridobili 615 bp dolg fragment tako iz pekočih in ne pekočih rastlin. To pomeni, da je C-terminalna regija CS enaka v pekoči in ne-pekoči papriki, medtem ko ima N-terminalna regija delecijo v ne-pekoči papriki. Za bolj natančno definicijo izbrisane regije, so oblikovali kombinacije začetnih oligonukleotidov, ki temeljijo na zaporedju klona BAC667I16 (Yoo, 2003; Yoo in sod., 2001, 2003). Produkti pomnoževanja genomske DNK pekoče paprike ʹHabaneroʹ in ne pekoče ʹHaehwaIIIʹ paprike z začetnima oligonukleotidoma BF5 in CSR4 so bili klonirani, sekvencirani in medsebojno primerjani. Rezultati so pokazali 2529 bp dolgo delecijo v zaporedju ʹHaehwaIIIʹ, kot je prikazano na sliki 5. Ta ugotovitev potrjuje naše prejšnje rezultate, ki kažejo, da N-terminal regija gena CS vsebuje 2,5 kb delecijo v ne pekoči papriki. Da bi ugotovili, ali je odkriti polimorfizem pekoče in ne-pekoče paprika, C. chinense cv. ʹHabaneroʹ in C. annuum cv. ʹHaehwaIIIʹ, reprezentativen tudi pri drugih sortah paprik, so nadalje tri pekoče in tri ne-pekoče sorte testirali s PCR z uporabo kombinacij začetnih oligonukleotidov, ki potrjujejo dolžinski polimorfizmu za CS. Kot so že opazili pri pekoči sorti ʹHabaneroʹ in ne pekoči ʹHaehwaIIIʹ (Slika 6), so pri vseh šestih kultivarjih 6

14 pomnožili 615 bp dolg fragment z začetnima oligonukleotidoma CSF3 in CSR4. Z začetnima oligonukleotidoma BF6 in BR8 so pri pekočih paprikah pomnožili 2800 bp dolg fragment in pri ne-pekočih paprikah kratek fragment dolg le 272 bp. Z začetnima oligonukleotidoma BF7 in BR9, se je pri pekoči papriki pomnožil 896 bp dolg fragment, medtem ko se pri ne-pekoči papriki ta ni pomnožil (Slika 5). Zato so kombinacije začetnih oligonukleotidov BF6 / BR8 in BF7 / BF9 uporabni SCAR markerji za gen CS in za fenotipsko napovedovanje pekočega okusa paprike. Slika 5: Primerjava pomnoževanja SCAR markerjev pri pekočih in ne-pekočih paprikah. PCR analizo so izvedli s šestimi različnimi pari začetnih oligonukleotidov. "P" je pekoča paprika, ʹHabaneroʹ. 'N' je ne pekoča paprika, ʹHaehwaIIIʹ (Choong in sod., 2004). 7

15 Slika 6: Za oceno uspešnosti prenosa SCAR markerjev tudi na druge genotipe so uporabili šest linij paprik. A. Pri kombinaciji začetnih oligonukleotidov BF6 in BR8 so pomnožili in 272 bp dolga fragmenta v pekočih in ne-pekočih genotipih paprike B. Kombinacija začetnih oligonukleotidov BF7 in BR9 pomnoži 896 bp dolg fragment samo v pekoči papriki. "P" je oznaka za pekočo papriko, linija 1, ʹCM334ʹ; linija 2, ʹPI159236ʹ; linija 3, ʹTabascoʹ. "N" je oznaka za ne-pekočo papriko, linija 4, ʹECWʹ; linija 5, ʹSladka Bananaʹ; linija 6, ʹPepperociniʹ (Choong in sod., 2004). Tako so pokazali uporabnost SCAR markerjev za žlahtniteljske programe paprike in filogenetske študije zaporedja regije, kjer je prisotna delecija CS gena pri ne-pekoči papriki. Razviti genetski markerji imajo neposredno uporabno vrednost za razločevanje pekočih in ne pekočih paprik v fazi sadik v žlahtniteljskih programih. Razvitih je bilo šest SCAR markerjev in kombinacije začetnih oligonukleotidov CSF1 in CSR4, CSF1 in CSR2 in BF7 in BR9 so pomnožile dominantne markerje, medtem ko so kombinacije BF5 in BR8 ter BF6 in BR8 pomnožile kodominantne markerje. Kodominantni SCAR markerji so veliko bolj informativni pri ne-pekoči papriki, saj vključujejo vidno delecijo fragmenta. Pomanjkanje dominantnih SCAR markerjev je ta, da ne prepoznajo ne-pekoče paprike od potencialne eksperimentalne napake. Ti markerji so bili zelo učinkoviti pri opredelitvi pekočega fenotipa različnih sort. V nekaterih primerih čilijev, ki so bili v testu okušanja razvrščeni kot ne-pekoči so se pokazali kot zelo malo pekoči s testi z uporabo SCAR markerjev in HPLC analizo. Izredno nizke vsebnosti kapsaicina ni lahko zaznati z metodo okušanja, vendar jih lahko zaznavamo z bolj občutljivimi metodami, kot je HPLC in tudi z genetsko analizo. Pomanjkljivost HPLC metode določevanja pekočega okusa je ta, da moramo počakati na zrele plodove, medtem ko lahko SCAR markerji določijo pekočo lastnost prej (npr. v fazi sejanca) in z neznatnimi količinami rastlinskega materiala. SCAR markerji, ki so bili razviti in predstavljeni, zagotavljajo natančen, enostaven, hiter in gospodaren način zgodnjega odkrivanja pekočega okusa pri rodu Capsicum. Ti SCAR markerji imajo tudi potencial za uporabo pri filogenetskih študijah rodu Capsicum in širše družine Solanaceae. 8

16 3.3 UPORABA MARKERJEV PRI GOJENJU NOVE SORTE SVEŽE PAPRIKE, KI VSEBUJE KAPSINOIDE Kapsinoidi so manj pekoči analogi kapsaicina, ki so jih prvič izolirali iz manj pekočega kultivarja Capsicum annuum ʹCH 19 Sweetʹ (Yazawa in sod., 1989; Kobata in sod., 1998). So podobne strukture kot kapsaicinoidi, vendar imajo estrsko skupino namesto amidne skupine. Kapsinoidi imajo podobne bioaktivnosti in bistveno manjšo stopnjo pekočega okusa kot kapsaicinoidi (Sasahara in sod., 2010; Luo in sod., 2011). Pekoč okus kapsinoidov je približno 1000-krat nižji v primerjavi s kapsaicini. Številne študije so pokazale, da kapsinoidi spodbujajo termogenezo z aktivacijo kapsaicin receptorja (Kawabata in sod., 2009). Poleg tega kapsinoidi kažejo delovanje proti debelosti, indukciji apoptoze, proti raku in imajo antioksidativne lastnosti (Rosa in sod., 2002; Haramizu in sod., 2011). Kapsinoidi so zaradi nižje stopnje pekočega okusa bolj ugodni kot sestavine v živilih in dodatkih kot kapsaicini. Za vnos kapsinoidov iz plodov paprik je treba zeleno papriko zaužiti surovo. Obstajata dva razloga za to. Prvič, ker so kapsinoidi nestabilni v vodi in ob segrevanju (Sutoh in sod., 2001), zato bi se morali izogibati termični obdelavi plodov paprik. Drugič, vsebnost kapsinoidov se zmanjšuje, ko plodovi dozorijo od zelenih do rdečih (Yazawa in sod., 1989). Vendar pa plodovi sorte paprike ʹCH-19 Sweetʹ niso primerni za uživanje surovi, ker so neprijetnega okusa in majhni. Poročali so o nekaterih drugih manj pekočih kultivarjih, ki vsebujejo kapsinoide (Tanaka in sod., 2010). Te sorte prav tako niso primerne za uživanje še ne-dozorele. Zato obstaja potreba po razvoju nove sveže sorte s primernim okusom in vsebnostjo kapsionidov. Takšno novo sorto se lahko razvije s križanjem med obstoječo svežo sorto in sorto, ki vsebuje kapsinoide. Vendar pa bi bil klasičen postopek križanja časovno zelo dolg in delovno intenziven, zaradi sajenja velikega števila križancev na različnih področjih in zaradi kemičnih analiz delov ploda, ker bi populacija kazala različne vsebnosti kapsaicina in kapsinoida. Namen te raziskave je bil torej oceniti uporabnost molekulskih markerjev, ki temeljijo na p-amt in Pun1 genih za pohitritev žlahtniteljskega programa za vzgojo nove sorte s primernim okusom za uživanje in dovolj veliko vsebnostjo kapsinoidov Križanje sort Poznamo papriko sorte ʹCH-19 Sweetʹ, ki vsebuje kapsinoide vendar ni primerna za uživanje. V opisanem žlahtniteljskem programu so razvili novo sorto, ki so jo poimenovali ʹMaru Saladʹ in katere rodovnik je prikazan na Sliki 7. Uporabili so pristop žlahtnjenja s pomočjo markerjev, pristop ki temelji na uporabi molekulskih DNA markerjev, ki pomagajo izbrati željene genotipe. Križali so papriki ʹCH-19 Sweetʹ in ʹMurasakiʹ. ʹCH-19 Sweetʹ je malo pekoč kultivar z veliko kapsinoidi, vendar ima majhne sadeže, ki so neprijetnega okusa. ʹMurasakiʹ je ne-pekoč svež kultivar, ki ne vsebuje kapsinoidov. Za določitev genotipa p-amt, je bil uporabljen pristop dcaps markerjev. Za dcaps analizo so genomsko DNA ekstrahirali iz listov mladih rastlin paprik. dcaps, je preprosta tehnika za genetsko analizo posameznih nukleotidnih polimorfizmov, ki temelji na restrikciji pomnoženih fragmentov. Kapsinoide in kapsaicine v zeleni zreli papriki so določili s HPLC metodo. Določili so vsebnost v 9-ih paprikah. Za populacijo, ki so jo križali 9

17 ʹMurasakiʹ ʹCH-19 Sweetʹ, so tri plodove iz ene posamezne rastline uporabili za oceno vsebnosti kapsinoidov. Za potrditev stabilnosti kapsinoidne vsebine, so gojili več kot 20 rastlin ʹMaru Saladʹ dve leti, in določili vsebino s tremi ponovitvami devetih plodov iz vsake rastline Razvoj novih kultivarjev Razvoj novih svežih kultivarjev, ki vsebujejo kapsinoide, z uporabo DNK markerjev. Pri dcaps analizi za gen p-amt so dobili 317 bp dolg fragment pri sorti ʹMurasakiʹ in 269 bp dolg fragment pri sorti ʹCH-19 Sweetʹ. Analiza markerja za gen Pun1 je pokazala da je sorta ʹMurasakiʹ brez fragmenta medtem ko ima sorta ʹCH-19 Sweetʹ 1670 bp dolg fragment. Gena p-amt in Pun1 lahko označimo kot A in B, torej sta genotipa ʹMurasakiʹ in ʹCH-19 Sweetʹ AAbb in aabb (Slika 8). F1 hibrid, ki izhaja iz križanja ʹMurasakiʹ ʹCH-19 Sweetʹ ima torej genotip AaBb, fenotipsko v glavnem proizvaja pekoče kapsaicine. Po križanju dobimo F2 rastline, rastline genotipa --bb (recesivna oblika Pun1 gena) niso proizvedle niti kapsaicina niti kapsinoidov (slika 8). Rastline genotipov AABB, AaBB, AABb in AaBb so pekoče, ki proizvajajo v glavnem kapsaicine. Paprike genotipov aabb in aabb pa so bile manj pekoče rastline, ki proizvajajo v glavnem alkaloid kapsinoid, ki je prijetnejšega okusa. Rezultati analize z DNA markerjema na podlagi dveh genov so se skladale z rezultati HPLC analize (Slika 8). Tako sta se p-amt in Pun1 gen izkazala za učinkovite markerje za izbor malo pekočih rastlin, ki proizvajajo kapsinoide. Potomci izbranih aabb in aabb rastlin so bili združeni, medsebojno oprašeni in DNA selekcija s pomočjo markerjev je bila ponovljena. S ponavljanjem selekcije in samoopraševanja je bila razvita nova sorta, ki je vsebovala želeno stopnjo kapsinoidov in je bila prijetnega okusa. Novo sorto so poimenovali ʹMaru Saladʹ (slika 7). 10

18 Slika 7: Rodovnik sorte ʹMaru Saladʹ, ki so jo požlahtnili s pomočjo molekulskih DNA markerjev (Yoshiyuki in sod., 2014). 11

19 Slika 8 : Skupno dedovanje biosinteze kapsinoida na podlagi analize P-AMT in Pun1 genotipov (Yoshiyuki in sod., 2014). Rezultati analize z uporabo DNK markerjev so se skladali z rezultati HPLC analize, zato sta se gena p-amt in Pun1 izkazala za učinkovite markerje za izbiro malo pekočih rastlin, ki proizvajajo kapsinoide. Surovi plodovi novo nastale paprike so bili primerni za uživanje in tako primeren vir kapsinoidov. Plodovi so bili večji kot pri papriki ʹCH-19 Sweetʹ. V tej študiji so bili p-amt in Pun1 markerji uporabljeni za žlahtnjenje nove sveže paprike, ki vsebuje kapsinoide imenovane ʹMaru Saladʹ, tako da so uporabili DNK markerje za detekcijo kapsinoidne biosintetične sposobnosti. Vse rastline genotipa --bb niso proizvajale ne kapsinoidov ne kapsaicinov. To je potrdilo da je dominantni alel Pun1 gena odgovoren za sintezo le teh, ob hkratnem predpogoju, da je rastlina recesivni homozigot za p-amt gen. Ugotovili so tudi, da če ima rastlina kapsinoidno biosintezno sposobnost, vendar je ne izrazi, jo lahko še vedno določimo z uporabo DNK markerjev. 4 SKLEPI Nedavno določeno zaporedje genoma paprike lahko služi kot pomemben genomski vir za izboljšanje hranilne in farmacevtske vrednosti, ki jo ima pekoča paprika in za podporo evolucijske in primerjalne genomike družine Solanaceae, enega od svetovno najbolj raznolikih rastlinskih družin. Capsicum je edini rod, ki je razvil biosintezo kapsaicinoidov, ki so sestavljeni iz več kot 20 sorodnih alkaloidov, ki povzročajo pekoč okus pri papriki. Določitev zaporedja genoma pekoče paprike omogoča razumevanje biosintezne poti kapsaicina in predstavlja odličen model za raziskovanje razvoja ostalih sekundarnih metabolitov v rastlinah. Genom paprike zagotavlja trdno osnovo za nadaljnje študije biosintezne poti kapsaicina pri rodu Capsicum z uporabo primerjalne genomike, presnovnega inženiringa in transgenih pristopov. V kombinaciji z nedavno objavljenimi genomi sorodnih vrst paradižnika in 12

20 krompirja, bo zaporedje genoma paprike pomagalo pojasniti evolucijo, raznovrstnost in prilagoditev več kot vrst družine Solanaceae, ki so prilagojene na širok spekter habitatov, ki segajo od suhih puščav do tropskih deževnih gozdov. Ponovno sekvenciranje dveh kultivarjev in de-novo sekvenciranje zaporedja vrste C. chinense zagotavlja prikaz genomske raznolikosti med Capsicum vrstami. Genom paprike bo omogočil napredek novih vzgojnih tehnologij z raziskovanjem genoma in izborom genomskih študij o hortikulturno pomembnih lastnostih, kot so velikost ploda, donos, pekoč okus, odpornost na abiotske strese, hranilnost in odpornost proti boleznim. SCAR markerji, ki so bili razviti in predstavljeni zagotavljajo natančen, enostaven, hiter in gospodaren način zgodnjega odkrivanja pekočega okusa pri rodu Capsicum. Ti SCAR markerji imajo tudi potencial za uporabo pri filogenetskih študijah rodu Capsicum in širše pri družini Solanaceae. Ker se v današnjem svetu vse bolj poudarja zdrava prehrana, bodo hranilne vrednosti in biološke funkcije paprike, zelo pomembne za pridelavo, saj poraba paprike v svetu še naprej narašča. V pomoč pri žlahtnjenju pa nam bo predstavljen genom paprike, poznavanje biosintezne poti kapsaicina ter molekulski markeji za odkrivanje pekočega okusa pri papriki. 13

21 5 VIRI Andrews J Peppers, the domesticated Capsicums. Austin, University of Texas Press, Austin: 186 str. Aguilar-Melendez A., Morell P.L., Roose M.L. & Kim S.C., Genetic diversity and structure in semiwild and domesticated chiles, Capsicum annum. Solanceae from Mexico. American Journal of Botany, 96: Blum E., Liu K., Mazourek M., Yoo E. Y., Jahn M., Paran I Molecular mapping of the C locus for presence of pungency in Capsicum. Genome, 45: Bosland P. W., Eric J. V., and Eric M. V Peppers: vegetable and spice capsicums. Centre for Agriculture and Biosciences International, 22: Choong-Jae L., EunYoung Y., Joo Hyun S., Jemin L., Hee-Sook H., Byung-Dong K., Nonpungent Capsicum Contains a Deletion in the Capsaicinoid Synthetase Gene, which Allows Early Detection of Pungency with SCAR Markers, Molecules and Cells, 2005, 19: Curry J., Aluru M., Mendoza M., Nevarez J., Melendrez M., O Connell M.A., 1999, Transcripts for possible capsaicinoid biosynthetic genes are differentially accumulated in pungent and non-pungent Capsicum spp. Plant Science, 148: Feschotte C., Jiang N. & Wessler S.R., Plant transposable elements: where genetics meets genomics. Nature Reviews Genetics, 3: Fraenkel L., Bogardus S.T. Jr., Concato J. & Wittink D.R Treatment options in knee osteoarthritis: the patient s perspective, Archives of Internal Medicine, 164: Haramizu S., Kawabata F., Masuda Y., Ohnuki K., Watanabe T., Yazawa S., Fushiki T., Capsinoids, non-pungent capsaicin analogs, reduce body fat accumulation without weight rebound unlike dietary restriction in mice. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry, 75: Ito K., Nakazato T, Yamato K., Miyakawa Y., Yamada T., Hozumi N., Segawa K., Ikeda Y., Kizaki M., Induction of apoptosis in leukemic cells by homovanillic acid derivative, capsaicin, through oxidative stress: implication of phosphorylation of p53 at Ser-15 residue by reactive oxygen species. Cancer Research, 64: Kang B. C., Nahm S. H., Huh J. H., Yoo H. S., Lee M. H., Kim B. D., Combined molecular linkage map construction using RFLP and AFLP in hot pepper. Theoretical and Applied Genetics, 102:

22 Kawabata F., Inoue N., Masamoto Y., Matsumura S., Kimura W., Kadowaki M., Higashi T., Tominaga M., Inoue K., Fushiki T., Non-pungent capsaicin analogs (capsinoids) increase metabolic rate and enhance thermogenesis via gastrointestinal TRPV1 in mice. Bioscience, Biotechnology, Biochemistry, 73: Kim M., Kim S., Kim, B. D., Isolation of cdna clones differentially accumulated in the placenta of pungent pepper by suppression subtractive hybridization. Molecules and Cells, 11: Kobata K., Todo T., Yazawa S., Iwa, K., Watanabe T., Novel capsaicinoidlike substances, capsiate and dihydrocapsiate, from the fruits of a non-pungent cultivar, CH-19 Sweet, of pepper (Capsicum annuum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46: Lefebvre V., Palloix A., Caranta C., Pochard E., Construction of an intraspecific integrated linkage map of pepper using molecular markers and doubled-haploid progenies, Genome 38: Lefebvre V., Pflieger S., Thabuis A., Caranta C., Blattes A., Chauvet JC, Daubèze AM, Palloix A., Towards the saturation of the pepper linkage map by alignment of three intraspecific maps including known-function genes. Genome, 45: Lejeune M.P., Kovacs E.M. & Westerterp-Plantenga M.S., Effect of capsaicin on substrate oxidation and weight maintenance after modest body-weight loss in human subjects. British Journal of Nutrition, 90: Luo X.J., Peng J., Li Y.J., Recent advances in the study on capsaicinoids and capsinoids. European Journal of Pharmacology, 650: 1 7 Marín A., Ferreres F., Tomas-Barberan F.A. & Gil M.I., Characterization and uantitation of antioxidant constituents of sweet pepper (Capsicum annuum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52: Potato Genome Sequencing Consortium. "Genome sequence and analysis of the tuber crop potato." Nature, : Rosa A., Deiana M., Casu V., Paccagnini S., Appendino G., Ballero M., Dessi M.A., Antioxidant activity of capsinoids. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50: Sasahara I., Furuhata Y., Iwasaki Y., Inoue N., Sato H., Watanabe T., Takahashi M., Assessment of the biological similarity of three capsaicin analogs (Capsinoids) found in non-pungent chili pepper (CH-19 Sweet) fruits. Bioscience, Biotechnology, Biochemistr, 74:

23 Seungill K., Minkyu P., Seon-In Y., Yong-Min K., Je Min L., Hyun-Ah L., Eunyoung S., Jaeyoung C., Kyeongchae C., Ki-Tae K., Kyongyong J., Gir-Won L., Sang-Keun Oh, Chungyun B., Saet-Byul K., Hye-Young L., in sod., Genome sequence of the hot pepper provides insights into the evolution of pungency in Capsicum species. Nature Genetics, 46, 3: Smeets A., Westerterp-Plantenga, M.S., Lejeune, M.P., Sensory and gastrointestinal satiety effects of capsaicin on food intake. International Journalof Obesity, 29: Surh Y.J., More than spice: capsaicin in hot chili peppers makes tumor cells commit suicide. Journal of the National Cancer Institute, 94: Sutoh K., Kobata K., Watanabe T., Stability of capsinoid in various solvents. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49: Tanaka Y., Hosokawa M., Miwa T., Watanabe T., Yazawa S., 2010a. Newly mutated putative-aminotransferase in nonpungent pepper (Capsicum annuum) results in biosynthesis of capsinoids, capsaicinoid analogues. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58: Tanaka Y., Hosokawa M., Miwa T., Watanabe T., Yazawa S., 2010b. Novel lossoffunction putative aminotransferase alleles cause biosynthesis of capsinoids, nonpungent capsaicinoid analogues, in mildly pungent chili peppers (Capsicum chinense). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58: Yazawa S., Suetome N., Okamoto K., Namiki T., Content of capsaicinoids and capsaicinoid-like substances in fruit of pepper (Capsicum annuum L.) hybrids made with CH-19 Sweet as a parent. Journal of the Japanese Society for Horticural Science, 58: Yoo E. Y., Kim S., Kim J. Y., and Kim B. D., Construction and characterization of a bacterial artificial chromosome library from chili pepper. Molecules and Cells, 12: Yoo E.Y., Kim S., Kim Y. H., Lee C. J., Kim B. D., Construction and characterization of a deep coverage BAC library of Capsicum annuum CM334. Theoretical and Applied Genetics, 107: Yoon J. Y., Pae D. H., Lee M. H., Breeding strategy for labor saving in cultivation and harvest, and diversification of quality in hot pepper, Capsicum annuum L. Journal od the Korean Capsicum Research, 1: Yoshiyuki T., Hirotsugu Y., Munetaka H., Tetsuya M., Susumu Y., 2014, Application of marker-assisted selection in breeding of a new fresh pepper cultivar (Capsicum annuum) containing capsinoids, low-pungent capsaicinoid analogs, Scientia Horticulturae, 165: